微粒(mps)量检测方法、条件的建立及其免疫学功能的实验研究.pdfVIP

3 微粒 （MPs）定量检测方法、条件的建立及其免疫学功能 的实验研究 中文摘要 目的：微粒 （MPs）作为细胞释放的一种“亚细胞结构”已经在自身免疫等多种疾 病中被发现。已有研究表明MPs可打破免疫耐受，触发自身免疫应答。本研究旨在 通过对MPs分析前影响因素的研究，建立一种MPs定量检测的优化平台，同时针对 血浆和细胞培养上清液中MPs 的研究，探讨其免疫刺激作用的发挥。 方法： 1 MPs ． 定量检测方法及影响因素的分析 （1）选取苏州大学附属第二医院住院SLE、RA及年龄和性别相匹配健康对照 HC 20 者（ ）各 例； （2）采用流式细胞术（FCM）和Bradford蛋白定量两种方法分别检测20例SLE 患者血浆中总MPs 的含量，并对比分析这两种检测方法的相关性； （3）流式细胞仪计数不同抗凝剂[枸橼酸盐，乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K ），2 肝素]和无抗凝剂血浆中总MPs 的含量； 4 [ PPP （）流式细胞仪计数不同标本洗涤方式洗涤贫血小板血浆 （洗涤 ）和直接 贫血小板血浆 （直接PPP）]下血浆中总MPs 的含量； 5 4 -20 -80 1 3 7 10 （）流式细胞仪计数不同保存温度（ ， ， ℃）和时间（ ， ， ， ， 14d）条件下血浆中总MPs 的含量。 2． MPs体外免疫学功能的检测 （1）血浆中MPs 的免疫学功能 a SLE 2 RA 29 ．选取苏州大学附属第二医院住院及门诊 患者 例、 患者 例及年 龄和性别相匹配HC40例； b SLE RA HC MPs LDMPs MDMPs ．流式细胞术分别检测 、 及 血浆中总 、 和 的 含量； c. 选取SLE、RA及HC患者各三例，将新鲜EDTA-K 抗凝血浆经过离心洗涤2 制成含有MPs 的洗涤贫血小板血浆（洗涤PPP），然后体外与PBMC共孵育48h，CBA 检测细胞培养上清液中细胞因子的分泌情况。 （2）细胞培养上清液中MPs 的免疫学功能 a LPS CAM STS THP-1 PMA+PHA CAM ．采用 、 及 刺激 细胞活化或凋亡；采用 、 及STS刺激Jurkat细胞活化或凋亡，同时流式细胞仪计数这两种细胞株刺激前及刺 激后细胞培养上清液中MPs 的释放情况； b THP-1 MDMPs 10 ．将凋亡 细胞来源的单核细胞微粒（ ）按照低、中和高浓度（ ， 20和40μg/mL）分别与Jurkat和PBMC细胞体外共培养 14h，流式细胞仪检测T细 胞表面中晚期活化分子CD71的表达情况； c. 将凋亡THP-1细胞来源的单核细胞微粒 （MDMPs）按照低、中和高浓度（10， 20 40μg/mL Jurkat PBMC 48h CBA 和 ）分别与 和 细胞体外共