嗜麦芽寡养单胞d2株碱性磷酸酶基因的克隆与表达.pdf

嗜麦芽寡养单胞菌D2株碱性磷酸酶基因的克隆与表达 摘要 目的本实验室tl沙蚕消化道分离的嗜麦芽寡养单胞菌D2株可大量胞外分泌某 单一蛋白。以纯化获得该蛋白为线索，根据该蛋白部分氨基酸序列，通过生物信息 学分析和分子生物学技术，获得该蛋白的完整编码基因，并在原核系统中诱导表达， 为进一步研究D2株该蛋白的分泌表达机制奠定基础。方法将D2菌株该蛋白纯品用 数据库中的BLAST工具进行对比，发现该蛋白的氨基酸片段均与嗜麦芽寡养单胞菌 序列保守区设计PCR引物，扩增D2株完整包含AKP编码基因的序列片段，将产物连 接至T载体中测序。然后设计带有酶切位点的引物，PCR扩增AKP的完整开放读码 并用IPTG诱导表达；表达产物用本实验室制备的D2AKP多克隆兔抗进行Western Blot鉴定，并检测其48h发酵液上清冻干浓缩后的碱性磷酸酶活性。结果以嗜麦 芽寡养单胞菌D2株的基因组为模板进行PCR扩增后，将产物测序，得到了一个1438bp 因的ORF前20个氨基酸为信号肽序列，推测此序列在在该蛋白的胞外表达中发挥了 重要的作用。酶活测定证明该蛋白48h的发酵上清具有碱性磷酸酶活性，酶活性约 为18．79金氏单位。结论成功获得了嗜麦芽寡养单胞菌D2株的AKP完整编码基因， 并进行了原核表达，经初步