mri评价腺病介导的酪氨酸酶基因在hepg2细胞表达的实验研究.pdf

◇!志蕊蔓 MRI评价腺病毒介导的酪氨酸酶基因在HepG2细胞表达的实验研究 M砒评价腺病毒介导的酪氨酸酶基因在 HepG2细胞表达的实验研究 学位申请者：邓贺然 专业名称：影像医学与核医学 指导老师：梁碧玲教授 中文摘要 研究背景 基因治疗作为一种新的治疗方法，被认为是医学科学中最新、最有潜力和最 可能发生革命性变化的领域。目前，基因治疗亟待解决的问题是在如何在活体实 时、无创伤地检测目的基因的表达、分布和治疗的疗效。分子影像学通过反映机 体内细胞和分子水平的改变，能够在活体上对基因治疗效果进行评价，而不影响 其生理活动，具有远大的前景。目前基因表达显像应用的主要技术手段包括：核 医学、MRI、光学成像。由于MRI空间分辨率高(己达∥m级)，设备比较普及，同 时可获得解剖及生理信息，MRl分子影像学成为近年来的研究热点。MRl分子影像 学以报告基因为基础，报告基因即基因的表达产物能与携带影像学标记物的分子 探针特异性结合，从而可为影像学设备所检测到的基因。其中一个热点研究的报 告基因是酪氨酸酶基因，酪氨酸酶是催化合成黑色素的关键酶。黑色素是一种阴 离子，能与铁等金属高效结合，降低了金属回旋的相关性时间，使MR的T1弛豫时 间变短，表现为特征性的T1]311权像高信号。 基因治疗的关键技术是转染，转染需要合适的载体。目前研究用的是非病毒 ◇!忠蠢点 MRI评价腺病毒介导的酪氨酸酶基因在HepG2细胞表达的实验研究 载体，虽然非病毒载体具有简便、安全、容量高的优点，但转染效率低且缺乏细 胞特异性，应用受到限制。为了进一步研究酪氨酸酶一黑色素报告基因系统，我 们需要寻找一种高效的载体。由于腺病毒具有许多优点，如使用安全，制备容易， 能获得高纯度、高滴度的腺病毒载体；以游离型存在，不整合进入宿主DNA中， 无遗传毒性；表达时间短暂，一般15-20天，适合一过性表达的需要；载导容量 相对较大，理论上可携带37kb的DNA；感染宿主范围较广，处于静止期的细胞也 能感染。本研究以酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞，观察腺病毒载体 运送酪氨酸酶基因转染体外细胞的效果。 研究目的 观察酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞的效果及黑色素的表达情 况。 l、构建酪氨酸酶基因腺病毒重组体。 2、利用酪氨酸酶基因腺病毒重组体转染HepG2细胞。 3、检测转染细胞DNA内报告基因导入情况及转染细胞内黑色素表达情况。 4、利用磁共振成像(MRI)对转染细胞进行扫描，观察转染细胞的信号特征。 材料和方法 一、酪氨酸酶基因转染 1、构建酪氨酸酶基因腺病毒重组体，委托东方肝胆外科医院病毒基因治 赠。 2、HepG2细胞的培养 用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，每2—3天换液一次。采用lOOmm直 径的一次性培养皿，待细胞汇合50％约106个细胞且处于对数生长期时使用。 3、转染 细胞生长达到106个时以无血清高糖DMEM培养液换液，在l、4号培养皿中分 别加入空白腺病毒载体及MOI为50、150、300的ad—tyr，作为对照组及实 X4m1)后换以 验组。转染6d,时后吸去含病毒培养液，PBS轻柔冲洗(2 II ◇!息黛 MRI评价腺病毒介导的酪氨酸酶基冈在HepG2细胞表达的实验研究 含10％胎牛血清培养液，培养72小时后以胰酶消化，行后续检测。5号培养 皿加入绿色荧光蛋白基因重组腺病毒。 二、MRI成像 胰酶消化后获取细胞悬液(经计数为106个细胞)，1200rpm离一5,5分钟使之 沉淀于EP管底，仔细吸除上清后将1’4号离心管平行放置，分别代表空白 500／15ms)、 对照及MOI为50、150、300转染病毒的细胞团。行T。WI(TR／TE 2600／lOOms)、STIR(TR／TE 扫描线 T。wI