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一株乳酸菌产类细菌素Enteriocin LK-S1的初步研究 王云华 李 健* (山东大学，山东 济南 250100) 摘要: 从鸡肠道分离的59株乳酸菌中，通过双层平板法试验，筛选出一株产类细菌素的乳酸菌，编号为SE-81。初步鉴定为肠球菌属（Enterococcus）。在排除有机酸和过氧化氢的干扰作用后，SE-81菌株对溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）等革兰氏阳性菌和大肠杆菌（Escherichia coli）及鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）等革兰氏阴性菌有强烈的抑制作用。用胰蛋白酶处理发酵上清液后，抑菌活性丧失。因此初步认为该菌株产生一类具有广谱抑菌活性的类细菌素物质，命名为EnteriocinLK-S1。它具有较广的抗菌谱，作用pH在4.0-6.0，有很好的热稳定性。 关键词: 肠球菌；类细菌素；乳酸菌；生物学特性 中图分类号: Q933 文献标识码: A 乳酸菌(Lactic acid bacteria LAB)是一类利用可发酵糖并产生大量乳酸的细菌的统称。长期以来，乳酸菌广泛应用于乳制品、蔬菜及肉制品的发酵和防腐中[1]。许多乳酸菌代谢除了产生乳酸、乙酸等有机酸和过氧化氢外，还能产生多种具有抑菌或杀菌生物活性的细菌素（bacteriocin），在抑制多种病原微生物和食物腐败菌等方面具有重要的作用[2]，其中以乳链球菌肽Nisin为代表。细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的具有抑菌活性的多肽或蛋白质。但它通常具有较为窄谱的抑菌活性[3]，仅仅抑制其亲缘关系很近的乳酸菌株和非乳酸菌的革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌和真菌则无效。类细菌素是用来描述那些不符合或不完全符合细菌素定义的拮抗物质。类细菌素不仅能抑制革兰氏阳性菌，而且对革兰氏阴性菌和真菌也有抑制作用[4]。这一特性决定了类细菌素具有比细菌素更为广泛的应用前景。目前关于乳酸菌产生细菌素的研究已深入到分子水平，而对乳酸菌类细菌素的研究却很少，国内尚未见报道。 本文对59株乳酸菌株进行了筛选，得到一株产类细菌素的菌株，该菌株是自鸡肠道中分离得到的，经鉴定为肠球菌，并对它产生的类细菌素EnteriocinLK-S1的生物学特性进行了研究。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 Enterococcus SE-81：自鸡肠道中分离得到 抑菌试验中的指示菌：溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、 乳酸乳球菌(Lactococcus lactic) 、干酪乳球菌（Lactococcus casei）、大肠杆菌(Escherichia.coli)、 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、海洋假单胞菌(Pseudomonas sp.)、黑曲霉（Aspergillus niger）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）均为实验室保存。 1.1.2 培养基 BCP 培养基和MRS 培养基参照文献[5]配制 指示菌生长培养基：LB、PDA和MA参照文献[6]配制 抑菌活性检测用底层培养基：指示菌生长培养基加入琼脂2% 抑菌活性检测用上层培养基：指示菌生长培养基加入琼脂0.75% 1.2 分析方法 1.2.1 乳酸的定量分析：采用40B型葡萄糖-乳酸分析仪（山东省省科学院） 1.2.2 EnteriocinLK-S1的制备：培养24h的发酵液，离心（8000rpm）去菌体，经过滤除菌得到发酵上清液。再经真空冷冻干燥成为干粉，即为类细菌素粗制品。用时以原体积1/5的无菌水重新溶解。 1.2.3 细菌数的测定：用血球计数板计数和平板统计菌落数（CFU/ml） 1.2.4 抑菌试验：牛津杯双层平板法。将各指示菌培养到指数期，经无菌水系列稀释到8.0×108CFU/ml，取100ul加入到4.5ml上层培养基中，振荡混匀，然后倒入预先准备的装有10ml底层培养基的平板上。向牛津小杯中加入0.15ml 乳酸菌发酵浓缩液，平板在室温下扩散3h，于38℃下培养12h，测抑菌圈的直径。 1.2.5 排除干扰因素：采用中和法排除有机酸的干扰；加入适量的过氧化氢酶（1mg/ml），37℃水浴保温1h，排除过氧化氢的抑菌作用。 2 实验结果 2.1 产类细菌素菌株的筛选和菌种分离鉴定 采用平板稀释法和厌氧培养技术，从鸡肠道中分离经纯化得到59株乳酸菌；通过牛津杯双层平板法，筛到一株编号为SE-81，对革兰氏阳性细菌和革兰