酶工程实验生物工程09ppt.ppt

本实验共有六个分实验 : 实验一 酵母蔗糖酶的纯化与纯度测定 实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度 实验三 酵母蔗糖酶的结晶（选做） 实验四 蔗糖酶酶学性质的研究 实验五 酵母蔗糖酶的固定化 实验六 酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰 酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26) 本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、加热除杂蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行初步检验。 结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力 静电引力大小与溶液的pH值有关，因pH值决定蛋白质的解离程度。 阳离子交换剂 样品溶液pH＜pI时，酶带正电荷； 阴离子交换剂 样品溶液pH＞pI时，酶带负电荷 一般样品溶液的pH与酶pI相差一个pH以上 样品溶液的pH与酶pI相差越大的，带电荷越多 通过逐渐增加洗脱液离子强度的梯度洗脱方式，可使结合在层析柱上的蛋白质按照结合力由小到大的顺序依次被洗出层析柱。 本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基（DEAE）。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。 离子交换柱层析的原理：根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术在分离过程中，以离子交换剂作用为主导。在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是： 1、开放性的长链结构、较大的表面积，所以对蛋白质吸附容量大；? 2、纤维素上离子基团数量不多且排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即可达到分离目的，不致引起蛋白质变 3、用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变，所以有利于蛋白质层析。本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基（DEAE）。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。 为了确定哪个峰是含目标酶，要进行酶活力的测定； 用蔗糖做底物反应一段时间后，检测生成的葡萄糖的量；用尿糖试纸初步检测；用DNS法精确检测。 DNS法精确检测 黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比而葡萄糖生成量又与待测液的酶活力大小成正比。 DNS法测葡萄糖浓度 附图：葡萄糖标准曲线 为了确定获得的目标酶纯不纯，要进行SDS电泳检测； 二、实验步骤 1.破碎细胞 取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第一组分。 2.加热除杂蛋白 将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第二组分。 3.乙醇沉淀 量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。 4.上柱 装DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡。将乙醇抽提液上柱，上样后用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡，然后用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3)进行NaCl梯度(NaCl溶液浓度为0-0.5 mol/L)洗脱。