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RNAi 沉默IGF-1R 表达对宫颈癌Hela 细胞生长和药物敏感性的实验研究 中文摘要 RNAi 沉默IGF-1R 表达对宫颈癌Hela 细胞生长和药物敏 感性的实验研究 中文摘要 目 的：宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，其发病率已超过结直肠癌， 仅次于乳腺癌，跃居女性恶性肿瘤的第二位。目前治疗宫颈癌传统的方法是手术、放 疗和化疗，但作用效果有限且副作用明显，而近几年来兴起的RNA 干扰（RNAi ）技 术给宫颈癌的治疗带来了新的希望。本课题选择与胰岛素样生长因子（IGFs ）信号传 导通路有关的胰岛素样生长因子1 受体（IGF-1R）作为研究对象，利用RNAi 技术， 通过构建IGF-1R shRNA 重组质粒表达载体转染人宫颈癌Hela 细胞，体内、外观察 沉默IGF-1R 基因对Hela 细胞生长的影响，并联合化疗药物顺铂刺激，以检测其敏感 性变化，为进一步研究宫颈癌的基因治疗奠定实验基础。 方 法：①根据GenBank 中IGF-1R 基因的cDNA 序列，通过软件分析IGF-1R mRNA 结构筛选出四个拟干扰靶位点，并设计四条干扰序列和一条与人类任何基因 均无同源性的阴性对照序列，并将其构建成IGF-1R shRNA 重组质粒表达载体，经测 序和酶切鉴定后，提取各重组质粒转染 Hela 细胞；②实验分为六组，即 pGPU6-IGF- 1R-1 组、pGPU6-IGF-1R-2 组、pGPU6-IGF-1R-3 组、pGPU6-IGF-1R-4 组、pGPU6-NC 组和空白对照Blank 组，分别进行体内外实验；③瞬时转染24h、48h、 72h 时，荧光显微镜和流式细胞仪分别检测各组细胞的转染效率；RT-PCR 检测各组 细胞 IGF-1R 和 MMP-9 mRNA 的表达；流式细胞仪检测 IGF-1R 蛋白表达； Hoechst33258 检测各组转染细胞的凋亡情况；CCK8 检测各组转染细胞的增殖能力及 对顺铂（DDP ）刺激的敏感性，根据以上实验结果从四条干扰序列中选择一条干扰效 果较好的序列用于后续稳定转染实验；④G418 筛选上述干扰效果较好序列和阴性对 照序列并获得稳定转染 Hela 细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测各组稳定转染细胞 的转染效率；RT-PCR 检测各组细胞IGF-1R 和MMP-9 mRNA 的表达；Western-blotting 检测各组IGF-1R、MMP-9 的蛋白表达情况；划痕实验检测各组细胞侵袭力改变；CCK8 检测各组稳定转染细胞的增殖能力和对顺铂（DDP ）刺激敏感性的变化；⑤各组稳定 I 中文摘要 RNAi 沉默IGF-1R表达对宫颈癌Hela 细胞生长和药物敏感性的实验研究 转染Hela 细胞接种BALB/c 裸鼠，12 天后分别腹腔注射0.9%氯化钠注射液（NS ） 和顺铂（DDP ），观察各组裸鼠成瘤时间、瘤体积和瘤重量的变化，免疫组化技术测 定IGF-1R 蛋白表达。 结 果：①酶切和测序结果表明成功构建 IGF-1R shRNA 重组质粒表达载体 pGPU6-IGF- 1R-1 、pGPU6-IGF-1R-2 、pGPU6-IGF-1R-3 、pGPU6-IGF-1R-4 和 pGPU6-NC ；②各重组质粒表达载体转染Hela 细胞，瞬时转染24h、48h、72h 时的转 染效率均达80% 以上，满足实验要求。RT-PCR 结果显示，三个时间点四个实验组均 能有效抑制IGF-1R 和MMP-9 mRNA 表达，以48h pGPU6-IGF-1R- 1 组抑制效果最为 显著（P0.0 1），其对IGF-1R、MMP-9 mRNA 表达抑制率分别为67.42%、39.21% ； CCK8 实验结果显示瞬时转染12h、24h、36h、48h、72h 各实验组细胞的增殖能力均 受到抑制，其中pGPU6-IGF-1R-1 组抑制率最显著（与其他三个实验组和对照组比较， P0.05 ）。CCK8 检测各组细胞三个时间点对DDP 刺激24h、48h、72h 后