一种用于hcv心蛋白体外表达研究的cho细胞模型的建立.pdfVIP

·中文论著摘要· 一种用于HCV核心蛋白体外表达研究的CHO 细胞模型的建立 目 的 建立稳定表达HCVC蛋白的CHO细胞模型，为研究HCVC蛋白与宿主细 胞的相互作用，阐述HCV感染致病机制奠定基础。 材料与方法 一、实验材料 1、质粒、菌株与细胞 pCMH6K由日本金泽医科大学综合医学研究所王春福博士惠赠；感受态菌DH5a 及含有10％FCS的DMEM中。 2、主要试剂 小量质粒提取试剂盒：Axygen公司；DMEM(Code 1 1 (Cat．No．1668—027)和048：Invitrogen公司；小鼠的单克隆抗体HepC tAg(C7—50) No．ZF．0312)： 北京中杉金桥公司；BamHI、Total 1 RNA提取试齐U(CodeNo．D908S)和RT-PCR 试剂盒(CodeNo．DRR019A)：TaKaRa公司。 3、引物 TCCACGAATCCT CAA 选自HCVC区序列：5’．仉～GGA A从CCTA．3’ GAA 为上游引物，位于HCVC区第348．366nt位点；5’．ACTTTCCCTCATTGC CATAGAGGG．3’为下游引物，互补于HCV CmRNA。 二、实验方法 l、pCMH6K转化与鉴定 将重组质粒pCMH6K转化到感受态茵DH50t中，通过含有氨苄青霉素的LB 琼脂培养筛选出阳性菌落，接种于3ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中， 225rpm、37C振荡培养过夜，参照小剂量质粒提取试剂盒说明书提取质粒，用 BamHI酶切，l％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 2、pCMH6K瞬时转染CHO细胞及免疫荧光检测 1： 10min，I％BSA封闭lh，／J口h,b鼠的单克隆抗体HepCcA甙C7-50)(0．I％BSA 1： 100稀释)，37℃避光孵育1h，于荧光显微镜下观察细胞并拍照。 3、pCMH6K稳定转染CHO细胞获得稳定表达的阳性细胞株 转染CHO细胞，24h后用0．25％胰酶以1：4密度消化传代，继续培养24h，待细 胞密度增至50—70％汇合时，加入800G418浓度筛选培养基加压筛选2w， mrdL 获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，半量G418(400 mg／L)维持筛选培养扩大 阳性克隆，继续传代培养110d以上，即得到稳定表达HCVC蛋白的阳性细胞株。 4、免疫荧光检测稳定转染细胞株中HCVC蛋白的表达 常规培养pCMH6K转染的CHO细胞，将其消化接种至6孔板中的盖玻片上， 培养24h细胞密度达到80％以上时，0．01MPBS液洗涤细胞3次，4％多聚甲醛固 cAg 2 光显微境下观察细胞并拍照。 5、RT-PCR检测稳定转染细胞株中HCVC基因的表达 将转染后不同时期细胞和未转染的细胞分别提取总RNA，以Random9为引 GGATCCA