不同冻存方法对骨细胞生物学特性的影响.pdf

}【Ill!Irl IIIII rillfrillIllrillI }Y1 不同冻存方法对软骨细胞生物学特性的影响 研究生： 胡 赛 专 业： 运动医学 导 师： 亓建洪 中文摘要 目的 通过比较慢速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻存法对兔关节软 骨细胞生物学特性的影响，选择较好的保存方法，为组织工程化关节软骨修 复软骨缺损的临床应用提供实验依据。 方法 2-4周龄新西兰大白兔，无菌条件下取其关节软骨细胞，进行体外的原 代培养。分别用慢速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻存法将所取的 兔关节软骨细胞进行冻存，冻存时间为2周、1个月后取出部分冻存管，37℃ 水浴复温后调定细胞浓度观察，以新鲜软骨细胞组作为对照组。对照组直接 原代培养后检测软骨细胞生长活力及其生物学特性。慢速连续降温法是将细 胞悬液和冻存液的混合液，分别装入冻存管，放入程控冰箱，以1℃／min的 速度连续降温至．80C后，迅速放入液氮中保存的方法。慢速梯度降温法是将 细胞悬液和冻存液的混合液在降至．80C之前，分4个梯度降温的保存方法。 玻璃化冻存法是将细胞悬液和玻璃化冻存液混合后，以最快的速度直接投入 液氮中保存的方法。不同冻存方法的细胞于冻存2周、1个月时取出，行甲 blot 苯胺蓝染色鉴定软骨细胞表型、CCK8法绘制软骨细胞生长曲线、Western 软骨细胞组作为对照组，比较各实验组软骨细胞的不同保存情况。 结果 1．软骨细胞的形态观察以及生长情况在显微镜下观察：分离培养的原代 软骨细胞呈圆球形，呈悬浮状态，接种24h后大部分细胞开始沉降于培养瓶 壁上，36h后贴壁率可达90％左右。贴壁后，细胞逐渐展开、变平、伸出短 小的突出，外观呈多角形、不规则形。细胞胞质丰富，胞核清楚，核圆形或 椭圆形，位于胞体中心，核仁为1．3个，具有折光性。约7d左右汇合成单层 铺满整个培养皿底面。传代后生长速度加快，约5d左右即可传代，细胞周 围可见具有折光性的细胞外基质，细胞长成一片可呈明显的“铺路石”状外 观。冻存2周复苏后，慢速梯度降温冷冻法的细胞生长形态较接近于新鲜软 骨细胞。慢速连续降温组和玻璃化组，细胞呈长梭形或多角形，细胞数目少。 冻存1个月时，实验组细胞生长形态均较对照组有明显区别，细胞胞质减少， 胞核不清晰。甲苯胺蓝染色显示，新鲜软骨细胞经细胞爬片后进行甲苯胺蓝 染色后镜下观察，软骨细胞染成蓝紫色，有核仁1．2个，对数生长期细胞明 显可见多数细胞有丝分裂相，细胞胞浆内见蓝紫色异染颗粒，细胞外基质染 成浅蓝色，集落样生长区中心浓染成紫红色。随着细胞传代，染色逐渐变浅 变淡。冻存2周、1个月时，各实验组于胞浆中仍可见蓝紫色异染颗粒，说 明经传代以及冻存后，各组细胞仍保持软骨细胞表型。 2．软骨细胞活性的变化新鲜软骨细胞组细胞生长曲线成对数型，保存2 周、1个月时，各实验组同对照组比较，细胞活性均较新鲜细胞组差。不同 实验组在冻存2周、1个月的时间点上，细胞生长活力冻存2周的生长情况 要好于冻存1个月的细胞且差异明显，有统计学差异(P0．05)。冻存2周 时，慢速梯度降温冷冻法组的细胞生长情况明显优于慢速连续降温法和玻璃 化冻存法，有统计学差异(P0．05)。冻存1个月时，慢速梯度降温冷冻法组 的细胞生长情况明显优于慢速连续降温法和玻璃化冻存法，有统计学差异 (P0．05)。不同冻存方法对软骨细胞生长活力的影响不同且随冻存时间的 变化对软骨细胞存活和率的影响也不同。随冻存时间的延长，曲线的峰值出 现的时间推后并且峰值降低。 3．软骨细胞的生物学特性II型胶原表达冻存2周时，慢速连续降温法、 慢速梯度降温法、玻璃化冻存法的II型胶原表达均减少与新鲜软骨细胞组比 较有统计学差异(P0．05)；慢速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻 存法的II型胶原表达两两比较有统计学差异(P0．05)。冻存1个月时，慢 速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻存法的II型胶原表达比较有统计 学差异(P0．05)。在两个时间点上，慢速梯度降