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组织工程脂肪移植预防硬膜外瘢痕形成 硕士生姓名： 陈亚楠 指导教师： 李正维教授 专业名称： 外科学 摘 要 目的：前脂肪细胞能定向分化为成熟脂肪细胞，而纤维蛋白凝胶与 多种细胞都具有良好的生物相容性。体外实验证明：前脂肪细胞可在纤 维蛋白凝胶中有效黏附、增殖并诱导分化为成熟的脂肪细胞。因此本次 实验将前脂肪细胞与纤维蛋白凝胶复合物植入体内。探索前脂肪细胞在 体内增殖、分化的可行性。从而为组织工程脂肪移植预防硬膜外瘢痕形 成提供理论基础。本实验研究的目的就是；体外分离培养大鼠的前脂肪 细胞并与纤维蛋白凝胶复合，回植入大鼠椎板缺损区，探索其复合体植 入大鼠体内预防硬膜外瘢痕形成的效果。 方法， (1)将80只大鼠随机分成4组。A组为前脂肪细胞-纤维蛋白 凝胶支架复合物植入组。B组为自体脂肪颗粒与纤维蛋白凝胶混合物植入 组。C组单纯自体脂肪颗粒植入组。D组为空白对照。(2)大鼠前脂肪细 胞的培养i将A组大鼠分别于lO％水合氯醛腹腔注射麻醉(0。35 mg／1009) 后。无菌取出附睾部腹股沟部脂肪组织。剪去脂肪组织中较大的血管和 结缔组织，用眼科剪将附睾部和腹股沟部混和脂肪组织剪成lmm3左右的 碎块。加入胶原酶消化液，37℃消化l小时，每五分钟振荡一次．通过孔 径为l00urn和25urn的尼龙筛．收取过滤液离心1 0分钟(6009)。弃去上清 液，加入红细胞裂解液，吹打均匀，室温静置10分钟。再次离心5分种， 弃去上清液，加入无血清培养液，吹打均匀，重复一次即得到前脂肪细 胞。将前脂肪细胞消化传代至底面积为25em2培养瓶中，加入完全培养液 养，每两天更换培养液一次，培养细胞至实验所需数量。(3)前脂肪细 胞与纤维蛋白凝胶混合物的制备。先将培养瓶中生长状况良好处于对数 生长期内的前脂肪细胞用0．25％的胰酶消化、离心，再用细胞记数板显微 镜下计数，然后用含l0％胎牛血清及诱导分化剂的DMEM培养液制作成 X 密度为1 10S／mll拘单细胞悬液备用。将纤维蛋白原加入含血清DMEM培 氯化钙的溶解液溶解，使其最后凝血酶浓度为100u／ml。向24：：J：L培养板每 孔滴入前脂肪细胞悬液100ul，加入预温至37℃的纤维蛋白原200ul，然后 加入凝血酶溶液100ul，震荡混匀后将培养板放入37℃培养箱内数分钟即 见凝胶形成。每孔再加入培养液，置于培养箱内，待植入A组大鼠椎板 缺损区。(4)组织工程脂肪的体内实验．1)动物椎板缺损模型制备及组 织工程脂肪的移植：各组的SD大鼠均以10％水合氯醛腹腔麻醉后，无菌 条件下手术。取背部正中纵行切口，切除L1．L3棘突及全椎板，造成 O．3cmxl．0em椎板缺损，切除黄韧带，清除硬膜外脂肪，保留完整硬膜。 制成椎板缺损模型。彻底止血后，清除所有显微镜下所能见到的软组织 纤维状物及碎骨片，A组植入前脂肪细胞．纤维蛋白凝胶支架复合物，B 组植入自体脂肪颗粒与纤维蛋白凝胶混合物，C组植入单纯自体脂肪颗 粒，D组为空白对照。植入时以铺满缺损区域为宜，关闭切口后，定期 观察椎板缺损区的瘢痕组织情况。2)标本制作、观察项目、检测方法及 2周各取3只大鼠，在手术显微 指标。(1)大体观察：分别在术后4、8、1 镜下按原手术入路进行解剖观察。将肉眼看到的硬膜外瘢痕按照改良 上，每组每次4只动物。完整取出手术段脊柱，置入10％的硝酸．福尔马林 混合液溶液中固定3d，再用50％的甲酸在室温下脱钙，然后标本中段取 II 材，常规脱水与石蜡包埋，5 m的连续切片，每个标本切片2张，其中1 张行HE染色，光镜下观察，按改良Nussbaum标准【ls】行组织学评分。1张 行VG染色，观察瘢痕中胶原的性质及其分布。(3)电镜观察。8周时在 X 显微镜下切取各组大体标本之硬膜外瘢痕，约1mm1．5ram×2mm大小， 经戊二醛固