雌激素对nf1irna肿瘤细胞模型生物学行为影响的研究.pdf

中山大学硕士论文 雌激素对NFIsiRNA肿瘤细胞模型生物学行为影响的研究 雌激素对NFlsiRNA肿瘤细胞模型 生物学行为影响的研究 专 业：神经病学 硕士研究生：程芙蓉 导 师：周列民教授 中山大学附属第一医院广州(510080) 中文摘要 1、研究背景 I型神经纤维瘤病(Neurofibromatosis1，NFl)是神经系统常见的常染色 type 体显性遗传病，临床表现多发牛奶咖啡斑、雀斑，虹膜错构瘤，骨骼畸形，认知 功能障碍，以及影响患者自尊甚则危及生命的多发神经纤维瘤和其它肿瘤。 神经纤维瘤具有复杂的肿瘤异质性，由施旺细胞、成纤维细胞和肥大细胞组 成的良性肿瘤。过去几年的研究在DNA，RNA和蛋白质水平上都显示施旺细胞是 神经纡维瘤的起源细胞，而且体内ras结合荧光检测显示是施旺细胞的神经纤维 蛋白缺失与ras活性的提高有关。成纤维细胞ras活性的缺失说明神经纤维蛋白 的缺失只发生在施旺细胞。这些结果均支持施旺细胞中NFI基因的失活是导致肿 瘤形成的关键，但却不能说明NFI+／一成纤维细胞和肥大细胞在肿瘤形成和进展 中的作用。 NFI基因编码蛋白一一神经纤维素含有与酵母IRA蛋白和哺乳动物的ras— GTP酶激活蛋白相同的功能区，ras—GTP酶激活蛋白主要作用是通过促使，a枞活 纤维瘤的发病机制主要与NFl基因突变导致施旺细胞ras-GTP水平增高有关，但 其确切的机制仍不是很清楚。 临床研究发现NFI患者神经纤维瘤的外显性有明显的年龄依从性，即青春期 中山大学硕士论文 雌激素对NFlsiRNA肿癌细胞模型生物学行为影响的研究 后期出现，成年期明显增加，晚年则停止或减少，这与体内雌激素分泌的生理特征 有明显的相关性。雌激素可通过调控抑癌基因和激活端粒酶等多种机制促进多系 统肿瘤的发生发展，而雌激素受体拮抗剂可抑制肿瘤的复发，提示神经纤维瘤的 形成除了因NFl基因突变导致施旺细胞异常增生外，体内雌激素水平的变化可能 也参与和介导了神经纤维瘤的形成和发展。 RNAi技术是通过双链RNA介导的特异性降解靶mRNA导致转录后基因表达水平 下降的一种现象，是近年发展起来的特异性抑制基因表达的重要手段，被广泛用 于基因功能的研究。最近，发卡样siRNA表达载体的应用为RNA干扰技术的推广 应用开辟了广阔的前景，其方法是通过合成靶基因的特异性发卡样短链寡核苷酸 序列，定向亚克隆入真核表达载体，再转染细胞后，通过胞内自身的RNA聚合酶III 的作用，自动释放出双链siRNA干预特异性靶基因mRNA的翻译。该方法简便易行， 构建的载体也易保存和大量扩增，因此倍受关注。业已证明：siRNA干扰技术是目 前研究基因功能最有效的方法，在体内外实验中得到广泛证实。 2、研究目的 本研究旨在采用RNAi技术，利用本课题组前期构建、筛选的NFl基因特异 表达，构建小鼠NFlsiRNA肿瘤细胞模型，并通过结合离体施旺细胞雌激素的干 预，探讨雌激素对NFl基因表达活性的调控作用，及其介导的施旺细胞生物学行 为改变，以研究雌激素在NFl神经纤维瘤发病机制中的作用。从而，为神经纤维 瘤的防治提供新思路。 3、研究方法 3．1雌激素对NFlsiRNA体外肿瘤细胞模型生物学行为的影响 3．L1取出生后4—7天的野生型C57BL／6乳鼠的双侧坐骨神经以及双侧臂丛神经 进行施旺细胞的分离培养。 3．1．2应用含有Geneticin的培养液，结合酶快速消化法和差数贴壁法，纯化施 旺细胞。 3．1．3用S100蛋白的免疫组化染色鉴定纯化后施旺细胞。 3．1．4施旺细胞纯度的测定方法：每张玻片选择10个高倍视野，计算阳性细胞含 量。 n 中山大学硕士论文 雌激素对NFlsiRNA肿瘤细胞模型生物学行为影响的研究 3．1．5 siRNA质粒1转染施旺细胞。 3．1。6将已成功构建的NFlsiRNA肿瘤细胞模型分为4组，分别为阴