凡纳滨对虾钙网蛋白cDNA序列br的克隆及组织表达分析.pdfVIP

— ３６— 江苏农业科学　２０１６年第４４卷第１期 郜卫华，田　罗，黄廷华，等．凡纳滨对虾钙网蛋白ｃＤＮＡ序列的克隆及组织表达分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（１）：３６－４０，４７． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．０１．００９ 凡纳滨对虾钙网蛋白ｃＤＮＡ序列 的克隆及组织表达分析 １，２ ３ １ １ １，２ 郜卫华 ，田　罗 ，黄廷华 ，姚　敏 ，许巧情 （１．长江大学动物科学学院水产系，湖北荆州４３４０２５；２．汕头大学广东省海洋生物技术重点实验，广东汕头５１５０６３； ３．荆州职业技术学院，湖北荆州４３４０２３） 　　摘要：利用ＲＡＣＥ技术，克隆了凡纳滨对虾钙网蛋白（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ，ＣＲＴ）基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＱ６８２６１８）。该基 因（ＬｖＣＲＴ）ｃＤＮＡ全长１８６６ｂｐ，含有１个长达１２２１ｂｐ的完整开放阅读框（ＯＲＦ），编码的成熟肽由４０６个氨基酸组 成，５′ＵＴＲ（５′非编码区）长度为２２２ｂｐ，３′ＵＴＲ长度为４２３ｂｐ，３′端加尾信号ＡＡＴＡＡＡ位于ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴上游２７ｂｐ处。 预测其理论分子量是１５．３ｋｕ，等电点ｐＩ为４．９０。具有１个保守的钙网蛋白家族标签（ＫＨＥＱＮＩＤＣＧＧＧＹＬＫＶＦ），１个 信号肽（ＭＫＴＷＶＦＬＡＬＦＧＶＶＬＶＥＳ）和保守的ＨＤＥＬ内质网回收标签。经ＮＣＢＩＢＬＡＳＴＸ比对表明，ＬｖＣＲＴ基因与中国 明对虾和斑节对虾的ＬｖＣＲＴ具有高度的相似性和一致性。系统进化分析表明，ＬｖＣＲＴ在亲缘关系上更接近昆虫的钙 网蛋白基因。荧光定量ＰＣＲ结果显示ＣＲＴ在肌肉组织中表达量最低，在肠中的表达量最高。对凡纳滨对虾 ＣＲＴ基 因全长ｃＤＮＡ序列克隆和表达的研究为更进一步了解ＣＲＴ多肽在凡纳滨对虾中的重要功能奠定了基础。 　　关键词：凡纳滨对虾；钙网蛋白；基因克隆；表达 　　中图分类号：Ｓ９１７．４　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１６）０１－００３６－０５ 　　钙网蛋白（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ，ＣＲＴ）最初是由Ｏｓｔｗａｌｄ等在兔肌 ［１］ １　材料与方法 肉细胞的糙面内质网中被发现的 。近年来研究表明，ＣＲＴ 不仅存在于内质网腔中，在细胞表面和胞外基质中都有表 １．１　试验动物 ［２－３］ 达 。Ｌｕａｎ等研究表明，ＣＲＴ在中国明对虾（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅ 试验用虾购自广东海兴农生物科技有限公司，于广东海 ｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）肝胰腺、鳃、肌肉、肠、淋巴器官、血细胞和卵巢中 洋大学东海岛实验基地水泥池暂养１周，取健康凡纳滨对虾， ［４］ 均有表达，其中卵巢的表达量最高 。成熟的钙网蛋白包括 经灭菌ＤＥＰＣ水清洗后，先将其冰浴麻醉，冰浴条件下分离血 ３个不同的功能结构域：Ｎ－功能域负责结构底物蛋白，Ｐ－功 细胞、肌肉、肝胰腺、肠道和鳃共５种组织，迅速装入 １．５ｍＬ 能域和Ｃ－功能域可以结合钙离子并使这种结合更加稳 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管（ＲＮａｓｅｆｒｅｅ），并立即投入液氮速冻，后转移 ［５－８］ 定 。目前为止，已公布的甲壳动物的钙网蛋白序列包括 至－８０℃冰箱保存备用。 中国明对虾 Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ＤＱ３２３０５４）、斑节对虾 １．２　总ＲＮＡ的提取 Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ（ＨＱ２５９０８５）和克 氏原螯虾 Ｐａｃｉｆａｓｔａｃｕｓ 取凡纳滨对虾血细胞、肌肉、肝胰腺、肠道和鳃共５种组 ｌｅｎｉｕｓｃｕｌｕｓ（ＨＱ５９６３６２）。 织，按照联合基因的ＵｎｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ（ＧＥＮＥｒａｙｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， 作为内质网分子伴侣蛋白，钙网蛋白除了在细胞功能中 Ｃｈｉｎａ）的操作步骤