02琼脂糖凝胶回收DNA片段和检测.pptVIP

实验 二琼脂糖凝胶回收DNA片段及检测 一、DNA片段的回收纯化 利用DNA凝胶纯化回收试剂盒（离心柱型）进行DNA纯化回收。 此试剂盒可用于琼脂糖凝胶DNA回收，PCR反应产物纯化回收，酶切产物DNA片段纯化回收，探针标记后纯化回收，DNA样品浓缩等。 1.试剂盒组成 溶胶/结合液DB 漂洗液WB 洗脱缓冲液EB 3M醋酸钠（PH5.2） 异丙醇 吸附柱 收集管（2ml） 2.原理简介 在高盐情况下，DNA片断选择性地吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤去除杂质（引物、核苷酸、蛋白酶等），最后低盐，高PH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。 3.操作步骤 1.在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。 2.将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。 注意：先称一个空1.5ml离心管重量，然后放人凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。 3.加三倍体积溶胶/结合液DB. 注意： 如果凝胶重为0.1g，其体积可是为100?l,则加入300?l溶胶液。凝胶块最大不能超过400mg，如果超过400mg，请用多个离心柱，进行回收。若胶浓度为2%，应加入6倍体积溶胶液。 4. 56℃水浴中放置10分钟（或直至胶完全溶解）。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。 5.每100mg最初的凝胶重量加入150?l的异丙醇，震荡混匀。 注意：加入异丙醇可以提高回收率，加入后不要离心。 6.将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。 注意：如果总体积超过750?l，可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中。 7. 加入700?l漂洗液WB(已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心1分钟，弃掉废液。 8. 加入500?l漂洗液WB 12,000rpm离心1分钟，弃掉废液。 9. 将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇影响下游反应。 10. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加40?l洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。 二、琼脂糖凝胶电泳 试剂： 1 ×TAE电泳缓冲液 琼脂糖 10×电泳加样缓冲液 溴化乙锭（EB） 1.制备凝胶 制备琼脂糖凝胶（1%） 1×TAE 50ml 琼脂糖 0.5g 放入50ml的锥形瓶中，加热溶化后再加入 溴化乙锭（EB）至总浓度为1 ?g /ml 灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却。 凝胶在室温下放置30min，使其自然凝结，小心拔出梳子。 将凝胶放入电泳槽中，向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。 2.加样 取回收的DNA样品20 ?l， 加样缓冲液3 ?l（6X），混匀，点入琼脂糖的样品孔内。 加样DNA marker DL2000 6 ?l 。 开始电泳（120V），当溴酚蓝迁移到距凝胶下缘2cm时，停止电泳。 利用紫外投射仪观察DNA条带。