DNA提取与PCR扩增文档.docVIP

ctab法dna提取液各种成分的作用是什么? 1、 裂解液要预热,以抑制DNase脱氧核糖核酸酶,加速蛋白变性,促进DNA溶解。 2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。 3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。 4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。 5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。 6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。 7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。 提取DNA配方 　　CTAB为十六烷基三甲基溴化铵， 　　CTAB提取缓冲液的经典配方 　　Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏； 　　EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性； 　　NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中； 　　Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。 　　CTAB 4g 　　NaCl 16.364 g 　　1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 　　0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。实验目的? 从新鲜的小鼠肝脏中提取基因组DNA，为southern杂交或DNA文库的构建做好准备。 我们重点是要保证DNA的序列、产率和纯度，去除Dnase、机械剪切 （对于如此之大的基因组，防止机械剪切是很重要的）、物理、化学因素的影响。 ? 实验原理及过程 ? 实验步骤 ? 实验原理 ? 1 将饥饿一天的小鼠用脊髓脱臼法处死。 饥饿一天是为了减少肝中的糖原，以免在提取DNA时糖的去除有太多困难。（试剂CTBA可以去除糖原） 2 0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 ? ? ? ? 当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA被降解。因为DNA并没有提出来，所以在这时重要的是防止DNA酶对基因组DNA的影响。 3 碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液，匀浆6次（冰上操作）。只能匀浆6次。因为这一步只是将细胞分开，不是破碎细胞。若在此时破碎细胞，细胞中的DNA酶会降解基因组DNA。低渗缓冲液破细胞，高渗缓冲液破组织。冰上操做也是为了降低DNA酶的活性。 4 匀浆液转入2mL小指管，40C , 5000rpm离心2min。 ? 5 沉淀加0.4mL无菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀 ? ? ? 破碎细胞。酶解液中含有蛋白酶K和SDS，这两种试剂不仅以温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA的完整性，又可以变性Dnase，还可以去除部分的蛋白。另外，还可以使核蛋白体从DNA上解离。（从以后的步骤开始，因为DNA酶已经被变性，而DNA也已尽被提出细胞，所以就要防止机械剪切对DNA的影响。） 6 550C 水浴酶解过夜，40C存放。 ? 7 加RNase ,终浓度200ug/mL，370C保温60min。 RNase可以去除RNA，在这一部降解RNA，可以在后面的步骤中将核苷酸也提走。 8 加等体积酚/氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min。 ? ?异戊醇防止液体在振摇时起泡，并能抽提部分的糖；酚可以变性蛋白质并使其沉降；氯仿可以提取脂类，液体分层。这里得酚是tris饱和酚，这样的酚饱和了水，不会抽提水层中的水，以致将DNA一并抽到有机层。Tris还可以起到调节PH稍微偏碱的作用。这时蛋白质沉淀于两层之间（密度的原因）。标记离心方向，因为沉淀有时看不见，而我们吸取液体是要从沉淀的反方向。缓慢颠倒混匀是为了减小机械剪切。 9 40C，10000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清因为肝脏中含有很多的酶（蛋白质），所以8，9步可重复一遍，效果较好。用扩口枪头是为了减小机械剪切。 10 上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀。 去除酚。 11 40C,10000rpm离心10min ，用扩口枪头取上清。 用扩口枪头是为了减小机械剪切。 12 上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇 脱水，因为液体中含有大量的盐（NaAc），使DNA沉淀下来，为丝状物。如果前面蛋白提取的不干净，会有弥散状的蛋白出现，应分清蛋白和DNA。 13 待DNA完全脱水而形成丝状物后，用扩