常用分子生物学技术的原理及其应用-YiLiao资料.pptVIP

利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析 （二）基因突变 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆转录PCR技术 三、几种重要的PCR衍生技术 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 背景 对数增长期 平台期 实时PCR技术原理 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引物 荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 实时PCR分类： 实时PRC 非探针类 探针类 1. TaqMan探针法 2. 分子信标探针法 3. FRET探针法 SYBR Green 图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图 第三节 基因文库 Gene Library 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 基因文库(gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 一、基因组DNA文库 基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有?噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。 Vector Type Insert size(thousands of bases) Plasmids Up to 15 Phage lambda(λ) Up to 25 Cosmids Up to 45 Bacteriophage P1 70 to 100 P1 artificial chromosome (PACs) 130 to 150 Bacterial artificial chromosome (BACs) 120 to 300 Yeast artificial chromosome(YACs) 250 to 2000 基因组文库和cDNA文库的构建和筛选 Digest the DNA with a restriction enzyme. This creates fragments that are similar in size, each containing one or more genes. Insert the fragments of DNA into vectors that were cut with the same restriction enzyme. Use the enzyme DNA ligase to seal the DNA fragments into the vector. This creates a large pool of recombinant molecules. These recombinant molecules are taken up by a host bacterium by transformation, creating a DNA library. 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、cDNA文库 第四节 生物芯片技术 Biological Chip Technique 是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(D