hbv相关肝细癌患者hbv x基因及前ss基因变异的分析.pdfVIP

HBV相关肝细胞癌患者HBVX基因及前S／S基因变异的分析 摘 要 目的：肝细胞癌(hepatocellular 见的恶性肿瘤之一，尤其在lE洲和非洲发病率极高。仅在我国每年新 发病例数就超过50万，年死亡率约20万例次。由于本病早期诊断不 易，缺乏有效治疗手段，_IIil：癌一旦临床确诊，预后极差。所以，加强 对肝细胞癌的病I因、发病机耻和，,itJ》J预防研究娃得极为迫切。目前国 内外学者认为肝细胞癌与乙型或丙型肝炎病毒感染、黄曲酶毒素、饮 BVirus， 水污染、酗酒等因素有关。尤其是慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis HBV)感染与肝细胞癌的发生有着密切联系。有资料显示，乙型肝炎 Bvirussurface 病毒表面抗原(Hepatitis 胞癌的危险性比HBsAg阴性者高217倍。而在肝细胞癌患者中，乙 型肝炎病毒感染率达到60％～90％。在肝癌细胞巾发现乙型肝炎病毒 的确切机制尚未彻底阐明，乙卅病毒DNA的整合、HBVX基因编码 产物反式激活作用、癌基因激活或抑痛基因失活、感染肝细胞免疫损 伤及再生肝细胞累积基因突变等是目前公认的HCC几大发病机制。 在以上过程中，多数伴有乙Hf病毒基因组变异。由于HBV复制过程 中容易发生碱基错配，而DNA聚合酶缺乏校正功能，常常发生基因 突变。乙型肝炎病毒基因组某些位点变异可影响HBV的生物学性状、 甚至影响其致病性，而且与乙型肝炎病毒感染者的临床进程和预后密 切相关。已有学者对Jl¨=痛患者休内HBV基因序列研究发现存在较多 列编码产物第79个氨基酸残基以卜I的202个氨基酸残基缺失，该产 物具有反式激活功能，川’以激活人C-myc癌基Ij；|；前S删除突变可导 伤、突变，从而诱导HCC发，Ii。又蜘I在川_离心者中存在高比例的核 患者中相当频繁。此外，在肝细胞癌中也发现前C／c基因区变异，但 与其它慢性肝病比较无差异性，提示该区变异与HCC发生可能没有 直接关联。P基因区是HBV基因组中最大的开放读码框，与多个基 因相重叠，该区的变异发生也较高，但该区变异一般影响病毒的复制 及前基因组RNA的包装，与肝癌发生的关系不大。可见乙型肝炎病 毒X基因及前S／S基吲变异与J}|习帛发，E的灭系更为密切。但HBV基 因变异与肝癌发生之问是否存在相关还有待证实。为了找出与肝癌发 病相关的特征性变异位点，以便为以后HBV相关肝癌防治研究提供 理论依据，我们使川高保真DNA聚合酶，对肌癌伴HBV感染患者 及其家族中HBsAg阳性者血清乙型肝炎病毒x和前s／S基因片段作 chain 聚合酶链反应(Polymerase 克隆并测序。根据S基因区编码氨基酸的差异，确定每株HBV基因 型和血清型。通过BLAST检索及与GeneBankHBV标准序列对比分 析，找出HBV相关肝癌患者与非肝癌HBsAg阳性者体内乙型肝炎病 毒基因变异差别。然后对两组资料进行统计学处理。方法：实验分组： 肝癌组9例，均为HBsAg阳性并经病理检查证实的HCC患者；对照 linked immunosorbent 联免疫吸附法(enzyme assay,ELISA)澳tJ定。留置 血清标本，酚氯仿法提取血清HBV 国株的相应保守序列设计引物。PCR扩增乙型肝炎病毒x基因及前 SIS基因片断，利用胶回收方法纯化相应目的基因片段，回收产物经 加A反应处理后分别与pBS．T载体连接并转化大肠杆菌ToplO感受 态细胞，在含氨苄青霉素、IPTG、X．gal的LB固体琼脂平板上过夜 培养。通过蓝白斑筛选阳性克隆。细菌增殖后抽提质粒作限制性核酸 内切酶切开，检测切下条带大小是否与日的基因一致，以初步判定重 组质粒有无相应基因片段，再将重组质粒PCR扩增相应目的基因片 段鉴定。将带有目的基因片断的重组质粒测序。测序引物为1r3或T7 通用测序引物。分别将各序列结果登陆GeneBank并与标准HBV株 对比，作基因分型及血清型攀定。然后将各序列分别与相同基因型的 标准株序列作BLAST检索对比，列出每株变异位点。同一变异位点 超过2株视为活跃变异位点。最后，将两组资料