il-1ra对鼠肝星状细胞ⅰ、ⅲ型胶原及timp-1mrna表达影响的研究.pdf

L-1 I ra对大鼠肝星状细胞I、III型胶原及TMP-ImRNA表达影响 的研究 摘 要 stellate 目的：用改良方法分离、培养及鉴定大鼠肝星状细胞(Hepatic I receptor IL—Ira)对HSCs I，Col—I)、III型胶原 antagonist I型胶原(Collagen inhibitorof metalloproteinase 防肝纤维化提供实验性理论依据。方法：取体重为48呛的Wistar大鼠1 只，禁食禁水12小时，以2％戊巴比妥钠腹腔麻醉，固定于手术台上。常 规消毒，以十字切口切开腹腔，翻出肠管，充分暴露门静脉，用留置针头 穿刺门静脉，固定，退出针芯，接通灌注系统。先用预灌注液(已预温至 37。C)进行灌注。然后迅速剪断后腔静脉，以每分钟10ml的速率缓慢灌注 约十分钟，当整个肝脏变成黄色时，换用已预热至37℃含Ⅳ型胶原酶 IV)溶液灌注，至整个肝脏几乎呈液状。此时，小心 (CollagenaseWype 将肝脏从大鼠腹腔中切除，将其置于无菌培养皿中，转入超净工作台进行 操作。首先将肝脏组织撕碎，去除肝包膜及结缔组织，剪碎肝组织，倒入 37℃)，所得细胞悬液依次经150目、200目金属网过滤，将滤液平均收集 于两个容量为50ml的离心管中。500×g离心7分钟，弃上清。每管加入 反复两次，弃沉淀。上清液500×g离心7分钟(20。C)，弃上清，沉淀用 15分 的离心管。在细胞悬液上小心滴加一层1640培养液，1500Xg离一t3 细胞悬液，以每孔103个细胞接种孔培养板中，每孔体积20吮1。将培养板 度为5mg／m1)溶液，继续培养4小时后，小心吸弃孔内培养液，每孔加入 sulfoxideDMSO)。然后在振荡器上振荡10 150lzl二甲基亚枫(Dimethyl 分钟，使吸附在细胞上的蓝色结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定光 结果。细胞存活率=实验组吸收值／对照组吸收值×100％。选择HSCs 细胞存活率在90％以上IL．1ra的浓度作为试验所需的浓度。取处于对数生 溶液，使其达到实验所需的浓度。低浓度组：加入配制好的IL—lra溶液， 用于大鼠的HSCs 48小时，提取总mRNA，然后进行逆转录，用实时荧光 ， 定量聚合酶链反应(Real lOng／ml、100ng／ml HSCs ±O．18，与对照组比较，不同浓度处理组IL．1raC01．I、C01．III和 论：改良的肝星状细胞分离方法简便、适用；IL．1ra以剂量依赖方式抑制 HSCs中C01．I、C01．III及TIMP．1mRNA的表达。 关键词：肝星状细胞；细胞培养；分离鉴定：白细胞介素．1受体拮抗剂； I型胶原；HI型胶原；基质金属蛋白酶组织抑制因子1 EffectsofIL-lraonThe of Expressions TIMP-lmRNAIn StellateCellsofRat