第二章分子克隆工具酶资料.pptVIP

思考题 用限制酶BglⅡ消化2ｕg λDNA ，该DNA浓度为 125ｕg/mL，BglⅡ为 4 units/ｕL.并提供了限制酶BglⅡ的10倍的缓冲盐体系。请设计一最佳方案来完成该实验 4.1 碱性磷酸酶 功能： 催化核酸脱5`-磷酸基团，使DNA或RNA片段5`-P末端转换成5`-OH末端。 来源： 有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前者叫bacterial alkaline phosphatase (BAP); 后者叫calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)。 碱性磷酸酶的活性 末端转移酶(terminal transferase): 是末端脱氧核苷酸转移酶简称。来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。 功能： 催化5`脱氧核苷三磷酸进行5`→3`方向的聚合作用, 逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端。 4.2 末端转移酶 末端转移酶的催化作用 用途： (1) 主要用于给外源DNA片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴； (2) 标记DNA片段的3`末端。 4.3 T4多核苷酸激酶 来源：T4 polynucleotide kinase来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 功能：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA的5`-OH末端（图）。 T4 多核苷酸激酶的活性（正向反应） DNA/RNA（单链或双链） T4多核苷酸激酶的交换活性 用途： （1）标记DNA的5`-末端； （2）使缺失5`-P末端的DNA发生磷酸化作用。 4.4 S1核酸酶 来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae） 功能： 是一种高度单链特异的核酸内切酶。 注意： 对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。 S1核酸酶的活性 用途： (1)测定真核基因中间隔子序列位置； (2)去除DNA片段中突出的单链尾巴； (3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。 核酶（ribozyme） 具有酶活性的RNA片段。 是真核生物转录产物地内含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪切。 1981 Cech和Altman首次发现，并因此获得1989年的诺贝尔奖。 核酶可以作为RNA的限制性内切酶用于基因操作。 1.5 限制酶的用途 1.???? 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制片断 2.???? 建立限制酶（物理）图谱绘制 3.???? 构建基因文库 4. 用限制酶切出相同的粘性末端，以便重组 2 DNA连接酶 2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项 2.1 定义及功能 DNA连接酶（DNA ligase）：可使一段DNA的3` 羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`- 磷酸二酯键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形成的切口的酶。 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。 J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\DNA连接酶. J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\连接酶.swf OH P 5` 3` 3` 5` 5` 3` 3` 5` DNA ligase DNA ligase 连接缺刻(nick) DNA连接酶 连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。 T4 DNA连接酶(ATP提供能量）和大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量）两种。 2.2 种类及作用机理 大肠杆菌的DNA连接酶 大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。 大肠杆菌的DNA连接酶 DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后,封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。  噬菌体T4DNA连接酶 噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还