第二章沉淀法资料.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白，它具有强烈的抑制蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。另外，还可用于分离纯化麦胚凝集素。 原理 鸡卵类粘蛋白在中性及偏酸性溶液中较稳定，对热、高浓度脲及有机溶剂均有较高的耐受性，在10％三氯乙酸或50％丙酮溶液中有较好的溶解度。本实验采用选择性变性沉淀、凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析等方法分离纯化鸡卵类粘蛋白。 在鸡蛋蛋清中，加入 10％TCA溶液作为初步分离，在pH3.5的条件下，杂蛋白变性沉淀，离心后，上清液中含有鸡卵类粘蛋白。 1) 取1个鸡蛋蛋清，加入等体积的10％TCA溶液，充分搅匀后，测定溶液的pH值（精密pH试纸），若偏离3.5，用10％ NaOH 溶液调pH3.5，室温静置4h以上。 步骤 2) 3000r/min离心10min 。收集清液，再用滤纸过滤并检查滤液的pH值是否3.5，若不是，则要调整。滤液量体积后转入500 mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置过夜。 3) 小心吸出部分上清液，剩余浑浊液转入50mL离心管中， 3500r/min 离心10min，弃清夜，将沉淀抽真空去净丙酮。 思考题 1、什么是沉淀法，具体包括哪些方法？ 2、理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析 3、盐析的机理是什么？ 4、影响盐析的因素有哪些？ 5、有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？ 6、用乙醇沉淀蛋白质时应注意哪些事项？ 7、何为选择性变性沉淀法？ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 10、盐析的影响因素1）pH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。 为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目的蛋白的等电点处。 注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液pH值，以达到最好的盐析效果。 pH值 PH 两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大； 等电点附近有极小值 pH 在进行盐折时，必须控制pH 图中直线都相互平行 Ks β pH值 2）温度的影响 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。 但在高盐浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 β随温度升高减小 Ks不随温度而变 3）蛋白质浓度 沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。 因此需要在两者之间进行适当选择。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。 对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。 11、盐析注意事项 选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸缓冲液 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤 盐析注意事项 硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使用前也需要用氨水调节至所需pH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。 12、盐析法特点 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后