第八章克隆基因的表达系统资料.pptVIP

第八章 克隆基因的表达 目的基因分离后，对研究者来说最重要的就是了解基因的功能。 只有当一个基因能正常表达时，我们才能了解基因的内幕。 基因的表达:指遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的过程 一、影响外源基因表达的因素 1、阅读框架：指基因的编码区，包含从起始密码子至翻译终止密码子之间的cDNA序列。 2、顺式作用元件 顺式作用元件对基因转录起始的调控 启动子 增强子 沉默子 顺式作用元件对转录终止的调控 终止子 衰减子 启动子 是RNA聚合酶识别,结合并起始转录的一段DNA序列,长度随生物种类不同而异.主要特征: 序列特异性: 方向性:结构一般是不对称的，正反两个方向只有一种具有启动功能 位置特异性 种属特异性: 增强子 远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列,由多个元件组成,每个元件可与一种或多种转录调控因子结合.最早在SV40中发现,作用方式特点: 双向作用 提高转录效率 无位置效应 远距离作用 组织特异性:只能在特定组织中增强与其相连的启动子的活性 无基因特异性 沉默子 远距离调节启动子以降低转录效率的一段DNA序列,是调节基因表达的顺势作用负调控元件,最早在酿酒酵母中发现 终止子 Terminator 为转录提供终止信号的一段DNA序列,是基因表达的顺势作用负调控元件. 衰减子 是原核生物基因表达调控的精细调节装置,是基因表达的负调控元件. 3 翻译过程对表达的影响 翻译是mRNA指导多态链合成的过程,包括多态链合成的起始,延伸和终止过程 翻译起始对基因表达的影响 原核生物起始密码子(AUG),SD,SD序列与起始密码之间的距离保持在9±3个核苷酸;真核生物的5’端帽子结构,起始密码子周边共有序列,有效的ORF是翻译所必需 密码子偏爱的影响 翻译终止的影响 终止密码子对翻译的效率有很大影响. UAA,UAG,UGA 4 表达系统对表达产物的影响 表达载体和受体细胞共同组成了外源基因的表达系统. 二、外源基因在原核细胞中的表达 (一)、原核生物基因表达的特点 只有一种 RNA 聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。 以操纵子为单位，数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位 转录和翻译偶联、连续进行。 不含内含子，缺乏转录后的加工系统 调控主要在转录水平上 mRNA的核糖体结合位点上含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA末端互补的序列,即Shine-Dalgarno（S-D）sequence mRNA上一段同核糖体16S RNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列 原核表达系统的注意事项 通过表达载体将外源基因导入宿主菌,并指导宿主菌酶系统合成外源蛋白 外源基因不能带有内含子,必须用cDNA或全化学合成基因 外源基因与表达载体连接后形成正确的开放阅读框架(open reading frame)。 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害 (二)、原核生物基因表达的调控序列 原核生物基因表达的调控序列主要涉及启动子,S-D序列,终止子,衰减子等序列 1.原核生物启动子结构 启动子 :是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列 ,是基因表达不可缺少的序列. 保守序列 -10区（Pribnow框）也称TATA-box,TATAAT -35区（Sextama框）TTGACA,是RNA聚合酶σ亚基的识别与结合位点 启动子 乳糖启动子lac---来自大肠杆菌的乳糖操纵子 色氨酸启动子trp-来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 PL和PR启动子 -?噬菌体中得到的一类启动子 比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高. -10 区顺序:GATAAT, -35区顺序:TGACTA tac启动子 由trp 和 lac启动子人工构建的杂合启动子 2.Shine-Dalgarno（SD）序列 位于翻译起始密码子（AUG)上游5-13bp处的由3-9个bp组成的核苷酸序列富含嘌呤核苷酸， 5’ UAAGGAGG 3’，，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 (1) SD序列的影响： 一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低 (2) SD序列与起始密码子之间的序列的影响 SD序列下游的碱基