第八章印迹技术资料.pptVIP

第八章　印迹杂交技术 第一节　核酸分子杂交 第二节　探针与标记 第三节　固相支持物与印迹 第四节　常用核酸印迹杂交技术 第五节　影响杂交的因素 第六节　蛋白质印迹法 第七节　生物芯片 目的要求 掌握基本概念（印迹杂交技术 、探针等）核酸分子杂交基本原理，核酸探针应具有的条件，核酸探针的种类，DNA印迹杂交的主要步骤。 熟悉常用印迹杂交技术和芯片技术 印迹技术(blotting) 核酸分子杂交基本原理 核酸分子杂交是指来源不同、具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链的过程。 （固相和液相杂交） 核酸探针的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上，然后可通过切口平移法、随机引物法、PCR标记法、末端标记法等方法标记探针 随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用 E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性） PCR标记法 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就可在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。 末端标记法 DNA末端末端标记法只是将DNA片段的一端（5’端或3’端）进行部分标记。由于标记活性不高，标记物掺入率低，一般极少用做核酸分子杂交探针标记。 末端标记法 探针的纯化 目的：除去游离的标记dNTP 方法：乙醇沉淀、凝胶过滤 DNA印迹杂交的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 印迹（转膜）： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 预杂交（封闭） 探针的制备 固相膜上杂交（控制温度） 洗膜：除去游离的探针 杂交信号的检测 印迹杂交过程 ⒈ 样品制备→⒉ 电泳分离→⒊ 印迹→⒋ 预杂交→ ⒌ 杂交→⒍ 洗膜→⒎ 分析 固相支持物 电泳用的凝胶不能直接做支持物 将核酸分子结合于表面 有较好的机械强度 常用硝酸纤维膜和尼龙膜 电转移法 真空转移法 预杂交 固相膜可结合DNA，包括探针。 封闭固相膜上多余的结合位点。 常用非特异性的DNA或蛋白质。 影响杂交的因素 杂交温度， 离子强度 DNA和探针浓度 杂交促进剂，聚乙二醇 杂交时间 Southern blotting Northern印迹杂交 是一项用于检测特异性RNA的技术。 Northern Blot 原位杂交 蛋白质印迹法 Western 印迹法（Western bloting）分析蛋白质的化学基础是其免疫原性，又称为免疫印迹法或酶联免疫电转移印斑法 用途： 鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，检测一目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。 典型的印迹过程包括三个步骤 ①蛋白质的电泳分离； ②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域； ③免疫学检测。 检测分析 应用举例 基因芯片与中医寒证的7类相关基因 对典型寒证而且用热药有明显疗效者，尝试用基因芯片筛选出59条差异表达基因表达谱（涉及到7类基因），探索寒证所涉及的相关基因类别。 方法： 精选对其治疗有明显疗效的典型寒证病例，在治疗前后分别采外周血，提取血液中的mRNA，再逆转录为cDNA以备检测。采用2035条人的靶基因cDNA制备成基因表达谱芯片。用两种荧光物质分别标记治疗前与治疗后cDNA，用其制备成探针与表达谱芯片进行杂交。 结果： 初步筛选出了差异表达基因59条，涉及到与能量代谢、糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、免疫和内分泌等7类基因。 与能量代谢相关的5条基因都为表达下调。 与糖代谢有关的2条基因也表现为下调。 与脂及酯类代谢相关的2条基因均下调。 与核酸代谢相关的基因10条以下调为主，上调为辅。 传统核酸印迹杂交的缺点： 传统核酸印迹杂交：Southern Blotting 和Northern Blotting等 技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等 生物芯片（biochips） ——指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。 待测样品用Cy3，发射562nm红色荧光 生物芯片技术（biochips） 生物芯片的特点： 高通量（一张芯片同时可分析千上万的分子