第章蛋白质工程资料.pptVIP

基因工程与蛋白质工程： 定点诱变 (site-directed mutagenesis) 在体外使DNA分子内部的特异部位发生突变的过程。 最常用的方法是合成一条序列有变异的寡核苷酸，使其与靶DNA分子杂交/退火，再合成完整的DNA。 产生随机突变的方法： 化学诱变，错掺诱变，盒式诱变。 高通量筛选法：从巨大数目的突变体库中筛选到具有期望功能的突变体。 筛选方法：表型观察筛选，当筛选的蛋白可以产生可见信号时，用简单的表型观察和筛选被广泛应用。 目前，蛋白质突变体库筛选一般是固态（琼脂糖和滤膜）或者液态（微量滴定孔板）条件下通过表型选择和筛选而完成的。 高通量筛选蛋白质突变体库的方法：噬菌体展示技术（phage display) 。　 基因内部剪接 在编码基因的内部插入或剪去特定的序列、结构原件或结构域。 5’或3’端的剪接 融合基因可以用于在体外产生不同基因或基因片段之间的融合，产生融合蛋白。 避免目的蛋白在表达时被降解 增加分泌性（信号肽） 提高溶解性（硫氧化还原蛋白） 重组酶的高效表达 一、细菌表达体系 二、酵母系统中的表达 三、丝状真菌中的表达 枯草杆菌蛋白酶的蛋白质工程 目前在原核系统中使用得最普遍的强启动子主要有5个： ① 大肠杆菌的lac启动子： ② 大肠杆菌的trp操纵子的启动子： ③ 将lac启动子的一10区和trp启动子的一35区融合起来的tac启动子； ④ T7噬菌体中基因10的启动子； ⑤ l噬菌体中的左向启动子PL 。 这些启动子都是通过和阻遏蛋白的相互作用，来控制基因转录的启动和停止的。 ?? lac/tac/trc启动子的表达调控 Plac +1 rbs FG Terminator ?? mRNA IPTG 阻遏蛋白 二、 酵母表达系统 例 1：Cu／Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是重要的医用酶。大肠杆菌表达体系能将N端的甲硫氨酸除去，但不能将第二个氨基酸(Ala)乙酰化。需用 真核系统表达！ 基因源：人的Cu/Zn-SOD cDNA基因 质粒载体：酿酒酵母 2 mm质粒 启动子：酵母甘油醛磷酸脱氢酶(GAPD)启动子 附加：转录终止信号、poly(A)信号。 宿主细胞：Leu缺陷型的酿酒酵母。 酿酒酵母表达质粒 酿酒酵母表达系统的缺点： 表达水平偏低 表达质粒易丢失 重组蛋白常发生超糖基化 分泌效率差 嗜甲醇的酵母(Pichia pastoris) 优点： 能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中快速生长。 ? 乙醇氧化酶基因aoxl的启动子是一个很强的诱导型启动子，甲醇诱导时，酶产量可达总蛋白的30％。 ? 毕赤酵母载体包括自主复制的游离载体和整合型载体， 由于没有稳定的附加体质粒， 所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载体。 宿主细胞为组氨酸脱氢酶缺陷型(HIS4一) 牛溶菌酶基因在嗜甲醇酵母中的表达 牛溶菌酶作用于细菌的细胞壁，具有抗蛋白酶的功能。可用作为促进反刍动物消化的饲料添加剂。 牛溶菌酶前体经P．pastoris正确修饰后分泌到培养基中，分泌的蛋白与天然溶菌酶活性相当，在10 L发酵罐发酵 200 h，产量达 2 g/L 。 丝状真菌 牛溶菌酶基因表达质粒 三、丝状真菌表达体系 得到发展主要理由是 ? 丝状真菌的发酵技术成熟，有利于重组蛋白生产 的工业化； ? 丝状真菌具有很强的分泌能力，有望提高重组蛋 白的生产效率； ? 新表达系统的建立可避开大肠杆菌生产重组蛋白 的专利限制； ? 米曲霉和黑曲霉等丝状真菌被FDA和世卫组织认 定安全。 质粒载体元件 在丝状真菌中的选择标记： 营养互补标记：ade(腺嘌呤)、trp等很多。 优点：载体质粒可进行同源整合，易于筛选； 缺点：大多数丝状真菌难获得营养缺陷型。 b. 显性标记：包括药物抗性标记，如潮霉素B抗性、卡那霉素抗性和苯菌灵抗性等 c. 细菌的报告基因：在丝状真菌启动子带动下的表达，也可作为选择标记，如 GUS 等。 表达水平： 与多种因素有关，包括选用的启动子及其他调控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷贝数和受体菌株等。 稳定性： 转化子在有丝分裂过程中，多数经过几十代的有丝分裂。但经过减数分裂表现出高度的不稳定。 第三节 蛋白质工程成果及应用 一. 蛋白质工程的成果 在十几年里,蛋白质工程已取得鼓舞人心成果。 1.基础研究方面: 酪氨酰tRNA合成酶是应用蛋白质工程技术研究得比较深入的酶之一。该酶在ATP存在的条件下可