实时荧光定量PCR技术的原理和应用.docVIP

实时荧光定量PCR技术的原理及应用 在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。 实时荧光定量PCR技术的基本原理 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数 。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。（如图1所示） （图1） 1.1数学原理 PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以用下式表达： Yn=Yn-1· (1+Ex) = Yn-2· (1+E)2=…= X·(1+Ex)n （ 0≤Ex≤1 ） 其中Ex表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1表示n-1个周期后PCR产物的分子数量。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增。实时荧光定量 PCR就是在PCR扩增的指数扩增期来测定起始模板的分子数量。 在实时荧光定量 PCR反应中 Rn =RB+XO(1+Ex)n RS,也就是说第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数量XO的乘积。当循环次数n = C时，则有RT=RB+XO(1+E)CtRS。两边取对数，得log(RT -RB) = logX0 + Clog(1+ Ex) + logRs。整顿此式， Ctlog(1+Ex)=-logX0+log(RT-RB)–logRs 则 而对于每一个特定的PCR反应来说，E、RT、RB和RS都是常数，因此 Ct=-klogX0+b 即Ct值与log X0成反比，也就是说，C值与起始模板拷贝数(X0)的对数成反比 （图2） 1.2化学原理 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括使用探针和荧光染料两种，探针是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，后者是利用荧光染料来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。 1.2.1 TaqMan荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸序列，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步（如图3所示）。 （图3） 1.2.2 SYBR Green I荧光染料 SYBR Green I 是