幽门螺杆菌caa基因在果蝇特定组织表达引起的表型变化及其对特定wnt信号通路成员表达的影响.pdfVIP

·中文论著摘要· 幽门螺杆菌cagA基因在果蝇特定组织表达引起的表 型变化及其对特定Wnt信号通路成员表达的影响 刖 声 胃癌是世界上第四大恶性肿瘤，同时它也是第二位导致死亡的肿瘤，每年有 超过70万人死于胃癌。流行病学研究提示幽门螺杆菌在胃癌发生中起重要作用。 中分离并培养。按照是否存在细胞毒素相关基因A(cagA)，幽门螺杆菌可分为cagA 阳性株和cagA阴性株。CagA蛋白通过IV型分泌系统被注入细胞内。移位后的 酪氨酸磷酸化的位点存在谷氨酸．脯氨酸．异亮氨酸．酪氨酸．丙氨酸(EPIYA)序 用于哺乳动物的细菌来源的癌蛋白，并且CagA酪氨酸磷酸化在幽门螺杆菌相关 的肿瘤发生起重要作用。近来还有研究表明CagA可通过磷酸化非依赖方式使 粘附连接的重要组成，同时也是Wm信号通路的关键分子。而Wnt信号通路是在 不同种属间高度保守，在发育和肿瘤发生中都起着重要作用。Wnt信号通路成员 APC或Axin基因的突变可导致结直肠癌，胰腺癌和肝细胞癌的发生。但Wnt信 号通路与胃癌的发生是否相关尚不清楚，而CagA作为胃癌发生的重要因素之一， 是否会影响到Wnt信号通路的活化也有待研究。 为此，本研究利用cagA转基因果蝇，研究其通过GAL4．UAS系统在果蝇复 眼与翅膀表达时表型变化情况，并且进一步研究了CagA对Wnt信号通路中 实验方法 一、pUAST-cagA—HA质粒的构建 成功，通过测序检测其基因序列是否正确。 二、eagA转基因的果蝇的制备过程 在苹果培养基平板上收集在30分钟内yw果蝇所产的卵，浸于NaCl0溶液中 脱壳处理后，蒸馏水洗净，将卵头尾一致整齐排列，放入硅胶盒中干燥5．10分钟， 矿物油覆盖。在倒置显微镜下从卵尾侧注射制备好的质粒。 由于个人技术原因，经过3个月的制备未成功获得转基因果蝇，美国奥勒冈 大学分子生物学学院Karen (yw；；UAS．HA—cagA)。本文实验所用cagA转基因果蝇皆为此品系果蝇。 三、复眼及翅膀中表达CagA果蝇的制备 将以上果蝇放置250C恒温培养约10天后产生F1代，在体视显微镜下观察子代Fl代 行自交配，观察其F2代果蝇表型情况。 四、表达CagA蛋白果蝇的胚胎的制备及应用免疫荧光染色方法 检测wingless、APC及Armadillo的表达 去除卵壳处理后，庚烷．甲醛混合液固定30分钟，经甲醇处理后，加一抗(兔抗 488 而后BBT溶液清洗，加入二抗Alexa anti．rabbit，546anti-mouse，647 goat anti．rat，室温孵育2h。BBT溶液清洗。荧光封片剂封片，激光扫描共聚焦显微镜 下观察并进行图像采集。 2 实验结果 1、pUAST-cagA—HA质粒构建成功 酶切结果表明质粒构建成功。利用测序引物进行测序，测序结果在NCBI网 站上进行Blot，结果与幽门螺杆菌NCTC 合。 2、CagA在果蝇复眼与翅膀表达诱导产生的表型变化 F2代出现重度糙眼突变果蝇。 变化 胚胎广泛表达。Win酉ess在CagA表达的胚胎中，其表达与对照组相比无变化。 与之类似，在CagA表达的同时，APC和Amadillo的表达也未见变化。 结 论 发育，导致果蝇糙眼突变及弯翅突变。 2、EPIYAA…BC 影响。 关键词 3 ● 英文论著摘要 ● The Inducedthe of in by Expression Phenotype cagA Tissueof andtheInfl