应用发夹rna技术对人肝癌hepg2细胞中期因子干扰作用的探讨.pdfVIP

应用发夹RNAi技术对人肝癌HepG2细胞中 期因子干扰作用的探讨 硕士生姓名：孙常铭 指导教师：袁 宏 教授 专业名称：临床检验诊断学 摘 要 目的：肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一川。其发病机制相当复杂， 其中肿瘤细胞中出现的与肿瘤发生的相关基因的的表达是其中的一个重 要发病机制。中期因子(MK)就是与肿瘤发生和发展有密切关系的基因。 MK能调节细胞生长、存活和分化，并参与肿瘤发病过程124】。许多不同 类型的肿瘤中表达增强，包括食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊 癌、肺癌、甲状腺、乳腺、膀胱、子宫、卵巢、前列腺和肝癌、神经细 胞瘤、恶性胶质瘤，髓系白血病【5】，阳性表达率介于45％～90％之间， 61。 MK在正常组织中不表达或低表达I RNA干扰[9](RNA 的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功 能表型缺失的现象。具有抑制作用强，稳定性高，细胞易摄取等优点。目前 RNAi在基因功能，抗肿瘤和抗病毒基因治疗等方面的研究已经取得新进 展17-9l。 达载体，转染入人的肝癌HepG2细胞。采用流式细胞术，MTT 白的表达，化疗药物的敏感性以及细胞凋亡等生物学功能的影响，初步探 讨MK在肝癌细胞中的表达意义，为开辟MK介导RNA干扰治疗肝癌提供 实验基础。 方法： 1．构建MK siRNA真核表达载体，进而鉴定插入序列的正确性。 2．利用阳离子脂质体将MK干扰质粒和通用阴性干扰质粒(HK)转染入人 l 的肝癌HepG2细胞，G48加压筛选，检测细胞克隆中Neo基因的表达，迸 一步得到阳性克隆。 V．FITC和PI双染法，通过 3．扩大培养阳性克隆和阴性克隆，应用Annexin 流式细胞仪检测检测转染后各组HepG2细胞的凋亡情况。 4．应用MTT比色法检测各组细胞对肿瘤化疗药物敏感性的情况。 5．应用RT-PCR的方法检测各组细胞中MKmRNA的表达情况。 6．采用Western．blot方法检测MK蛋白的表达情况。 结果： 胞，和正常HepG2细胞形态发生改变。 细胞中均有Neo基因的表达。 比阴性对照组和空白组分别提高了l5．5倍和9．34倍。 4．应用含有不同浓度的顺铂和5氟尿嘧啶的细胞培养液培养细胞48小时 后，应用MTT法检测，同一药物浓度的三组细胞，转染MK阳性干扰质粒的 疗药敏感。 了89．3％和77．3％ 肿瘤细胞发生凋亡增强，同时提高了HepG2细胞对顺铂和5氟尿嘧啶等化 疗药物的敏感性，为开辟MK介导RNA干扰治疗肝癌提供实验基础。 RT-PCR Western·blot 关键词：RNAi 凋亡 药敏 LiVer Oil Human EffectHepG2 Interference The Interference RNA Through Cancer Sun Postgraduate：Changming Yuan Hong Supervisor：Professor