感染红色荧光蛋肝癌细胞的实验研究及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立.pdfVIP

感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立 中文摘要 感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究及双色荧光示踪 肝癌原位移植瘤模型的建立 中文摘要 第一部分 感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究 目的: 通过慢病毒感染建立稳定高表达红色荧光蛋白（RFP）的人肝癌细胞 HepG2/RFP和鼠肝癌细胞Hepa1-6/RFP，并探讨肝癌细胞感染前后的一些基本生物学 和遗传学特性是否受到影响。 方法：将同时载有红色荧光蛋白 （RFP）基因及嘌呤霉素抗性基因的慢病毒感染 人肝癌细胞HepG2及鼠肝癌细胞Hepa1-6，然后经嘌呤霉素筛选获得的细胞分别命名 为HepG2/RFP、Hepa1-6/RFP。在荧光显微镜下观察感染后的细胞形态；HepG2/RFP、 Hepa1-6/RFP 30 FACS 30 细胞体外传代培养 代，通过流式细胞术（ ）检测传代 代前 后细胞感染RFP 的阳性率；采用PCR检测肝癌细胞基因组中RFP基因的表达情况； 通过CCK-8法、Transwell细胞侵袭实验、染色体分析实验，Western-blot实验比较感 染前后肝癌细胞的增殖曲线、侵袭力、染色体核型及数目、相关蛋白AFP 的表达水 平等变化情况。 结果: 经嘌呤霉素筛选后，两肝癌细胞红色荧光蛋白的感染率都高达98％以上； PCR结果证实RFP基因成功整合至肝癌细胞中；肝癌细胞感染前后细胞的增殖曲线、 侵袭力、染色体的核型及数目、相关蛋白AFP 的相对表达量几乎没有改变。 结论 本实验建立的人肝癌细胞: HepG2/RFP及鼠肝癌细胞Hepa1-6/RFP 既能稳 定高表达RFP，又可以保持其原有的基本生物学及遗传学特性不变，为进一步进行肝 癌追踪性研究及治疗提供了一个有用的新工具。 关键词: 红色荧光蛋白 ；肝癌细胞；慢病毒 I 中文摘要 感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立 第二部分 双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立 目的 建立红、绿双色荧光示踪的肝癌原位移植瘤模型，并初步分析其基本特征。: 方法：将稳定高表达红色荧光蛋白的人肝癌细胞HepG2/RFP 和鼠肝癌细胞 Hepa1-6/RFP接种于全身表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的裸小鼠肝右叶，建立双色 荧光示踪的肝癌原位移植瘤模型。采用活体荧光成像仪实时动态观察移植瘤的生长转 移情况，然后取肝癌组织作连续冰冻切片，取肝癌原代组织培养，并在显微镜下观察 移植瘤的组织结构特征。 结果：成功建立了红、绿双色荧光示踪的肝癌原位移植瘤模型，建模成功率为 100％。实时活体成像可检测到早期肿瘤的生长及转移，红色肿瘤团块随着移植时间 的延长而增大、增多，并从肝区向肝外组织迁移。在荧光显微镜下观察移植瘤切片， 不仅直观显示了重构的肝癌组织区域有大量的绿色宿主细胞和红色肿瘤细胞交织在 一起，而且肝癌细胞的侵袭、迁移及肝癌细胞与宿主细胞的融合等也清晰可见，甚至 HE Hepa1-6/RFP 可以精确到单个细胞水平。常规 染色基本符合肝癌的基本特征。 肝 癌原代组织的培养也证实了融合细胞参与了肝癌组织 “重构体”的组成。 结论: 双色荧光示踪的肝癌原位移植瘤模型能够在活体内观察肿瘤的生长和转 移，清晣显示肿瘤细胞与宿主细胞的位置和相互作用关系，为研究肿瘤细胞侵袭、转 移和肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的作用提供了－个新的可视化实验平台。与传统 型相比较，具有更高的实用价值。 关键词:肝细胞癌；双色荧光示踪；原位移植模型；活体荧光成像系统；细胞融合 作 者：王