羊水间充质干细体外诱导为表皮样细胞及法舒地尔对其作用的实验研究.pdfVIP

中文摘要 羊水问充质干细胞体外诱导为表皮样细胞及法舒地 尔对其作用的实验研究 摘 要 第一部分：羊水来源胎儿间充质干细胞的体外培养及诱导为 表皮样细胞 目的：探讨孕中期羊水来源胎儿间充质干细胞(MSCs) 体外诱导分化为表皮样细胞的可能性。 方法：在产前诊断或自愿引产的孕妇中，通过超声引导 下羊膜腔穿刺获取人孕16．22周羊水10例，机械方式分离细 胞，体外培养传代，挑取孕中期羊水细胞培养体系中的胎儿 MSCs集落，培养扩增。经传代、扩增、纯化至第3—5代。 观察细胞生长特性并记录胎儿MSCs生长曲线，通过流式细 胞仪检测表面抗原表达。取生长良好的第3代胎儿MSCs， 应用培养液B(70％培养液A+30％成纤维细胞培养基上清液 +10 显微镜观察诱导后细胞形态的变化。诱导20d时运用免疫组 织化学方法和流式细胞仪检ON,0CKl9的表达，免疫荧光染色 共聚焦显微镜观察结果。 结果：胎儿MSCs在体外培养体系中增殖迅速，培养3d 后，在倒置相差显微镜下观察，可见单个或少量集落生长的 贴壁细胞，形态大多成梭形或针尖状，部分呈圆形、多角形， 核位于中央，核仁可见。8d后，形成散在的梭形细胞为主、 中文摘要 类成纤维细胞的MSCs集落和多角形细胞为主类上皮细胞集 落，集落间不接触。机械挑取胎儿MSCs集落接种培养后， 细胞呈均匀分布生长，形态呈梭形、针尖形或星形。培养7—8d 形成集落的数目、大小明显增加，细胞排列有一定的方向性， 呈旋涡状、网状及辐射状排列生长，可达90％融合，相互之 间界限不清。流式细胞仪鉴定结果示胎儿MSCs为CD44阳 性，CD34阴性。诱导培养20d后，细胞由原来的长梭形成 纤维细胞状结构逐渐变短，细胞紧密排列成片，细胞化学鉴 定结构显示有CKl9的表达，免疫荧光染色共聚焦显微镜结 果显示有表皮样细胞标志物CKl9的细胞。 结论： 1羊水来源胎儿间充质干细胞可在体外分离、纯化培 养，生长稳定、增殖速度快，可连续传代。 2羊水来源胎儿间充质干细胞随着传代次数的增加增 殖能力有逐渐降低的趋势。 3羊水来源胎儿间充质干细胞在成纤维细胞培养上清 液联合EGF的体外培养条件下有向表皮样细胞分化的趋向。 关键词：羊水细胞；胎儿间充质干细胞；分化；表皮样 细胞 第二部分：盐酸法舒地尔对羊水来源胎儿间充质干细胞向表 皮样细胞分化的影响 目的：观察不同浓度的Rho分子信号通路阻断剂盐酸法 舒地尔(HAl077)对羊水来源胎儿间充质干细胞向表皮样 细胞分化的影响。 中文摘要 方法：按照实验一的方法获取生长良好达到90％融合的 L—DMEM+1 0％FBS+青霉素100U／ml+链霉素1 00“g／m1)培 养、传代；将第2、3、4、5组，弃培养液A，无菌PBS冲 洗，分别换用培养液B(70％培养液A+30％成纤维细胞培养 基上清液+10 HAl077+培养 ng／LEGF)、培养液C(10pmol／L 液B)、培养液D(20I．tmol／L HAl077+培养液B)，置培养箱中培养，每隔2 E(409mol／L —3天更换各自培养液1次，细胞生长达到90％融合时用O．25 养3代。第l组为空白对照组，第2组为单纯诱导组。用倒 置显微镜定期观察各组细胞形态及其生情况。诱导20d时1～ 5组均用流式细胞仪检测CKl9抗体表达情况，所得数据均 以阳性率表示，采用SPSS统计分析软件、运用X2检验进 行各实验组阳性率的比较。诱导20d时将第2组和第4组进 行RT-PCR检测。 结果：20d时流式细胞仪检测各实验组CKl9的表达阳性 率分别为O．37％、3．08％、2．39％、3．40％、3．12％，浓度为 20I，tmol／L 势。经诱导培养的第3组和第5组，20d时细胞由原来的长 梭形成纤维细胞状结构逐渐变短，细胞紧密排列成片，与对 照组细胞