沉淀技术要点.ppt

第4章 沉淀技术 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？ 常用的沉淀方法包括哪些？ 何谓盐析？其原理是什么？ 影响盐析的主要因素有哪些？ 盐析操作过程 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步 纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，但仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 ⑴蛋白质周围的水化层 保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 ⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。 蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。 根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8）选择性变性沉淀法。 盐析 概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。 　 盐析法机理 （1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。 1 盐析用盐的选择 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 （1） 价廉 ； （2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； （3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好， （4）不易引起蛋白质变性。 盐析操作(加盐方式） 硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； 2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。 每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系 ㏒S=β-ＫsＩ S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度， I=1/2∑mizi2 mi—离子 i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常