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第十三章 高效液相色谱法 第一节 液相色谱仪器（high performance liquid chromatograph） 液相色谱仪（2） 液相色谱仪（3） 液相色谱仪（4） 二、高效液相色谱法的特点 （feature of HPLC） 特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试 样的高效分离分析方法。 三、流程及主要部件 （process and main assembly of HPLC） 2. 主要部件 (1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm）， 液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高 压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。 (2)梯度淋洗装置 外梯度: 利用两台高压输液泵，将 两种不同极性的溶剂按一定的 比例送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调 节阀，将两种或多种不同极性 的溶剂按一定的比例抽入高压 泵中混合。 (3) 进样装置 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示： (4) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 (5) 液相色谱检测器 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机 化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm ×10mm，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变 化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 b. 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。 光电二极管阵列检测器 c. 示差折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最 多的检测器； 可连续检测参比池和样品 池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质 具有不同的折光指数）；灵敏 度低、对温度敏感、不能用于 梯度洗脱；偏转式、反射式和 干涉型三种。 示差折光检测器 d. 荧光检测器（fluorescence detector） 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。 第二节 主要分离类型与原理 一、液-固吸附色谱 （liquid-solid adsorption chromatography） 固 定 相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂。 流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 二、液-液分配色谱 （liquid- liquid partition chromatography） 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流 动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反； 固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。 三、离子交换色谱 （ion-exchange chromatography） 固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流 动 相：阴离子