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置换色谱技术及其在生物分子分离纯化中的研究 08级生物工程 张烁 韩美蓉 蒋俊 梁语燕 * 引言：置换色谱的发展史 置换色谱概念的首次出现是在1943 年, 由Tiselius 提出，同时， Tiselius也建立了较为完善的置换色谱的理论。但是除了在稀土元素和同位素的分离中仍使用置换色谱外, 在以后的几十年里, 受低效的色谱系统及填料的限制, 该技术很少有人再使用。直到80 年代中期, 随着HPLC 技术的发展和高效色谱填料的深入研究, Horvath等将置换色谱应用于生物分子的分离与纯化, 才使该技术重新崛起。 Tiselius  置换色谱( displacement chromatography) 作为一种非线性色谱技术, 是指样品输入色谱柱后, 用一种与固定相作用力极强的置换剂( displacer ) 通入色谱柱, 去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进, 使样品中各组分按作用力强弱的次序, 形成一系列前后相邻的谱带, 并在置换剂的推动下流出色谱柱。 连续离子交换技术和工业色谱技术工厂设备 一、置换色谱的基础 1. 分离机理 置换色谱的操作程序包括色谱柱的平衡、上样、加置换剂、洗脱、分步收集和色谱柱再生这一系列过程。 置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等温线有直接的联系。置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等温线应为Langmuir型, 而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能力, 其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方[ 1] , 见图1。 图1 样品组分和置换剂的等温线 以及操作线 根据物料平衡方程, 置换剂在柱中的移动速度uD 有下列关系: 式中u0 为流动相的线速, 为相比, qD 和cD 分别为置换剂在固定相和流动相中的浓度, qD/ cD 是直线OD 的斜率, 称之为操作线( operating line) 。 uD = u0/[1 + ( 5qD/ 5cD)] (1) * 　 此时, 样品中不同的组分以置换剂的速度前进, 即达到等速状态( isotachicconditions) : uD = u2 = u3 = u4 （2） 式中u2、u3、u4 指被置换的三组分的速度。 图2 置换色谱图 当操作线的斜率小于被分离组分等温线的起始斜率, 样品才能进行置换展开, 最终形成如图2中的置换序列, 这是在理想的情况下( 假定无轴向扩散及二次化学平衡) 获得的置换色谱图。每一组分形成矩形的平台( plateau) 洗脱峰, 相毗邻各组分的平台洗脱峰组成了一个台阶状的色谱图。 * 其中c2 、c3 和c4 分别是在置换展开达到平衡时组分2、3、4 在流动相中的浓度, q2、q3、q4 是相应的在固定相中的浓度。由图1 ，图2可以看出, 组分1 由于其吸附等温线的起始斜率低于操作线的斜率, 因而没有被置换, 而以洗脱展开方式的对称峰流出色谱柱。各组分在样品中的原始浓度及进样量的大小决定了平衡时各组分在置换序列中谱带的宽度, 因此, 只要确定了置换剂的浓度和流速, 就可以预测各组分置换洗脱液的体积、浓度和洗脱时间。置换剂的浓度既控制了产物的浓度, 也控制了整个色谱运行的速度。 由( 1) 和( 2) 式可以得出 2. 置换展开方式的优点与局限 A、同传统的洗脱色谱方式相比, 置换展开则有如下优点: ( 1) 允许上样量比洗脱色谱高得多, 尽管如此, 在置换分离过程中, 被分离组分仍能以相当高的纯度获得高产率; ( 2) 各组分在分离过程中能形成较清晰的界限, 消除了洗脱分析中的拖尾现象, 提高了样品组分的回收率; ( 3) 产物浓度的可控性; ( 4) 需要较少的溶剂; ( 5) 与亲和色谱不同, 可同时分离纯化几种物质。 * B、置换色谱尽管具有一系列其它色谱展开方式无法比拟的优点, 但它本身也存在着局限性 （1）色谱柱需要再生; （2）吸附等温线不具备Langmuir 型的化合物不能用于置换展开; （3）缺乏合适的置换剂是影响该技术广泛应用的最主要的原因, 因此,置换剂的选择和设计在置换分离过程中至关重要 为了解决置换色谱的操作难度大的难题，科学家又做出了大量的的改进研究：Gerstner 和Cardinli 等的联机检测装置、Freitag 及其合作者开发的了全自动置换序列监测手段等 连续工业色谱分离小实验设备 分析型HPLC 二、影响置换色谱分离的因素 1. 置换剂 置换剂的选择是置换色谱能否成功地分离和纯化目标产物的关键因素之一。理想的置换剂必须符合以下条件 : （1）与样品中其它组分相比, 对固定相的吸附力最强, 而且呈现Langmuir