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CD、TK自杀基因的构建及鉴定 摘 要 目的：根据国内外的研究现状，选择有效的自杀基因系统(CD／5．Fu， TK／GCV)。将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞， 使肿瘤细胞产生某些酶类，将原来无毒的前体药物代谢转化成细胞毒性 产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为“自杀基因”。 一些报道阐述试图通过双基因共表达的策略联合应用胞嘧啶脱氨酶／5． 种自杀基因系统。另有研究CD基因转导的肿瘤细胞在前药治疗后有放 射增敏作用。为此，我们利用分子生物学技术，构建CD、TKI!I杀基因 BANK发表的碱基序列具有同源性。为进 并测定其结构，证实与GENE 一步研究目的基因的高效准确表达和新的生物学功能提供了实验基础。 法，在反应条件为：50m mol／L2 模板3．0 2．0 gl，dNTP(2．0raM)5山，Mgcl2m，引物各为l}ll(5 min)舌94。C变性 I．unol／L)，Tag酶O．5山。反应参数：94C预变性5 60 S，55℃退火90S，72℃延伸75S，35个循环后；72℃最终延伸20 min。扩增出约为1284 bp特异性目的片段。取含CD基因片段的PCR扩 增产物40ul，1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化CD基因(1284bp)。取纯化产 9C连接过夜， 物3ul}Jfl入载体PGEM-Tlul，在T4DNA连接酶作用下，18 构建PGEM-T．CD重组质粒。取连接产物转化感受态细胞大肠杆菌 挑选阳性重组子。取阳性克隆菌落，摇菌过夜，提纯质粒后，-幺空PCR及 酶切鉴定初步证实重组体后，送上海生物工程技术服务有限公司测序认 证。该公司分别用T7及SP6通用测序引物从两端测定基因全序列， Omega基因分析软件进行基因序列分析。(2)以人类单纯疱疹病毒I型 基因组为模板，利用PCR法，在反应条件为：50ulPCR反应体系中含 人类单纯疱疹病毒I型基因组DNA模板10．0皿，dNTP(2．0 mM)5叫， 2．0mol／L Mgcl2 2lxl，引物各为l山(2．5 数：94。C预变性5min后；94C变性60S，60。C退火90S，72。C延 min。扩增出约为1100 10075S，35个循环后；72℃最终延伸20 bp特异 100 lul，在 泳分离纯化TK基IN(1bp)。取纯化产物3ul加入载体PGEM—T 琼脂培养皿，利用蓝自菌斑显色，挑选阳性重组子。取阳性克隆茵落， 摇菌过夜，提纯质粒后，经PCR及酶切鉴定初步证实重组体后，送上海 生物工程技术服务有限公司测序认证。该公司分别用T7及SP6通用测序 引物从两端测定基因全序列，Omega基N1分析软件进行基因序列分析。 bp，TK 结果：经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定表明，CD基因片段约为1284 基因片段约为1100 bp，扩增的片段大小均与预计一致。酶切鉴定显示， I、Not I酶切，切出片段约为(CD) 重组质粒PEGM．T．CD分别用BarllH 分别用NotI、Xhol 3000bp，与预计大小～致。PCR鉴定显示，