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人巨细胞病毒对脐血红系祖细胞HOXB6基因表达的影响 摘 要 reverse chain transcription quantitive polymerize 方法，检测经人巨细胞病毒(human retinoic ／或全反式维甲酸(a11．transacid，ATRA)和／或三氧化二砷 (arsenic FormingUnit—Erythroid，CFU-E；BmstForming 的HOXB6(homeoboxB6gene)基因的mRNA定量表达情况，在基因 水平探讨HCMV感染导致造血红系祖细胞损害的机制。方法：1．3 例脐血标本由本院产房提供，取白正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘 段脐血。采用造血祖细胞体外培养技术，以HCMV持续感染和／或 验分组：实验分成6组①空白对照组：在正常培养体系中，不加任何 的处理因素。(重)HCMV组：按100TCIDso 感染正常的培养体系。③ATRA组：在正常培养体系中加入维甲酸， 毒组中加入维甲酸，终浓度同上。⑤As203组：在正常培养体系中加 样的人巨细胞病毒组中加入三氧化二砷，终浓度同上。3．采用原位 联苯胺染色法鉴定红系祖细胞。4．不同时问点即第3天，第7天， 第10天分别提取各组细胞RNA，用1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检 测RNA分子的完整性。5．利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 技术和随机引物将总RNA逆转录成cDNA，设计基因特异引物在实 甘油醛脱氢酶(gluceraldehydephosphate 因阳性产物cDNA梯度稀释制作各自的标准曲线，根据各个样本循环 threshold，Ct)和标准曲线斜 指数增长期的起始点即循环域值(cycle 率值计算各样本起始cDNA模板量倍数值，以GAPDH基因作为内参 照进行标化，统计并分析各组样本的H0Ⅻ6基因表达的mRNA是 否存在差异。统计方法：结果用均数加减标准差(i±S)，进行单因 素方差分析，有统计学意义后组间均数用两两比较方法，由统计软件 SPSSll．5完成。结果：1．集落细胞的形态学鉴定，原位联苯胺染色 法证明所培养的是造血红系祖细胞。2．1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 显示RNA电泳图的5s，18s，28s三条带型整齐，无明显拖尾及弥散， 说明RNA结构完整，无明显降解。3．逆转录PCR扩增三组均有目 基因mRNA在6个组即正常的红系祖细胞，HCMV感染后的红系祖 用ATRA／AS203处理的红系祖细胞中定量表达情况，经过单因素方差 for 分析和SPSSll．5windows统计分析结果显示，在正常培养体系中 红系祖细胞随第3天，第7天，第10天时间推移持续表达HOXB6 基因，且表达持续上调；在HCMV感染后，红系祖细胞HOXB6基 因的表达随着第3天，7天，10天时间的推移与空白对照组比较，明 显持续下调，即表达被抑制；ATRA组与空白对照组比较，能持续显 著上调红系祖细胞的HOXB6基因的表达，且随着第3天，第7天， 第10天时间延长，表达量逐渐升高；ATRA也能上调对HCMV感染 后的第3天和第7天红系祖细胞的HOXB6基因的表达，但是ATRA 对HCMV感染后的第10天红系祖细胞HOXB6基因的表达与空白对 照组相比统计学上无显著差异；AS203与空白对照组比较，能随着时 间推移逐渐下调红系祖细胞和HCMV感染后的红系祖细胞的 HOXB6基因的表达，结果有统计学意义；与HCMV组比较，结果无 统计学意义。结论：1．HOXB6基因在脐血红系造血祖细胞中持续稳 定的表达，且与红系造血有密切的相关性。2．HCMV感染能诱导脐 血红系造血祖细胞HOXB6基因表达下调，HCMV有可能通过调控 调控HOXB6基因的表达。4．本实验采用Trizol试剂提取脐血红系造 血祖细胞总RNA，所得产物RNA纯度高，完堑洼好，产物浓度无明 显差异，无DNA污染，操作简便，适合于从细胞中提取总RNA的 实验。5．本实验采用FQ．RT-PCR技术具有检测范围宽，敏感性高， 精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，产出率高，可以 进行多重检测的优点，该方法是一种对HOX基因在红系造血祖细胞 表达进行定量或定性研究的理想方法，是当