体外诱导分化的经元在温敏型壳聚糖中的生长观察.pdf

中文摘要 体外诱导分化的神经元在温敏型壳聚糖中 的生长观察 摘 要 目的：脑损伤后不可逆性的神经元网络破坏和胶质细胞 脱失，阻碍了脑组织结构的重建，造成相应神经功能缺损。 神经组织工程技术的发展为中枢神经系统损伤的修复提供 了新思路、新方法。组织工程的关键是种子细胞和生物材料 接合构建三维空间复合体。壳聚糖(C)与B一甘油磷酸钠(GPl 按一定比例混合得到一种温敏型水凝胶，具有生物相容性 好、无毒性、可降解等特点。当它注射到体内后，在温度、 pH值等因素作用下完成溶胶一凝胶转变，使操作简单、创伤 小、塑型方便，是良好的支架材料。本实验将体外诱导的神 经元样细胞与C／GP进行联合培养，观察细胞的生长状况。以 了解C／GP对神经元样细胞生长、增殖、分化的影响及与神经 元样细胞的生物相容性，探索以C／GP为载体与神经元样细胞 制成组织工程材料的可行性，为体外诱导的神经元的脑内移 植寻找较合适的可注射性载体提供实验依据。 方法：1骨髓基质细胞的培养：50--609的sD大鼠，麻 醉处死，分离双侧胫骨和腓骨，暴露并冲洗骨髓腔，用贴壁 stromal 培养法，分离出骨髓基质细胞(marrow cell，MSCs) 并连续传代、扩增，获取更纯化的MSCs。 2诱导分化神经元：取第3代MSCs，加入0．2m∥珊l的三磷 酸胞苷二钠(CTP)，每天观察细胞变化，约10天左右可见 较多的神经元样细胞。做神经元特异性烯醇化酶(NSE)、 神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组化染色鉴定细胞。 中文摘要 3温敏型水凝胶的制备：称取脱乙酰度91％的壳聚糖(cS) 溶于lml去离子水中。消毒后室温下按不同体积比逐滴将B -GP溶液滴入不断搅拌着的CS溶液中，分别测混合液的PH 值及370C条件下的凝固时间(以凝胶在容器内倒置90。不流 动、不变形为凝胶形成的标准)，选择最适混合比。 4神经元在C／GP凝胶中的培养与观察：将培养的神经元样 x 细胞制成密度为2 105／ml细胞悬液与C／GP混合，接种于96 u u 孔培养板，每$L20 l细胞悬液!JI]C／OP复合物lO1，设为实 u u 验组；每孔取20l细胞悬液加lOl完全培养基，设为细胞 u u 对照组；每孔取101C／GP复合物加完全培养基201，设为 C／6P对照组。每日换液1次，并在倒置显微镜下观察神经元 三维培养的生长情况。 5 MTT法细胞活性检测及生长曲线的绘制：实验组、细胞对 照组分别在24h后每组取5孔细胞、C／GP对照组取1孔(测 实验组0D值时调0用)加入MTT液，倒置显微镜下观察细 胞形态及分布，酶标仪测吸光度(OD值)，连续观察7天绘制 生长曲线。对两组的oD值作t检验，进行统计学分析。 结果：1分离的MSCS呈圆形，胞体透亮。接种24h后， 少量细胞贴壁，72h后大部分细胞贴壁，形态为梭形、圆形、 多角形，8一lOd细胞达到90％融合，细胞呈长梭形排列呈栅 栏状，传代后的MSCS贴壁较快约24h完全贴壁，3—7d基本 铺满瓶底。 2加诱导剂后3d细胞突起逐渐伸长呈单极或多极同时胞体 变圆，光晕明显，随时间的延长不同细胞突起之间有交叉连 接现象，lOd左右神经元样细胞数量最多。免疫组化呈NSE、 中文摘要 GFAP染色阳性表达。 3可注射水凝胶的物理性状：壳聚糖稀盐酸溶液呈淡黄色透 明粘稠液体，pH值为5．65，56％的甘油磷酸钠水溶液呈无色 透明液体，pH值为8．91。壳聚糖与B一甘油磷酸钠的体积比 不同，C／GP溶液的PH值及37℃凝固时间亦不同(表1)。其 养箱中胶凝时间约为lOmin，较为理想。 4神经元细胞在C／GP凝胶中三维培养：24h后倒置显微镜下 观