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单克隆抗体制备技术 2008年11月6日 杂交瘤技术的基本原理 HAT培养基的选择原理： A：氨基蝶呤 A 是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨基蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。 B：瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。 C：B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5~7d，且功能下降 。 D：融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。 免疫程序与检测方法的建立 免疫程序 建立检测方法 检测免疫效果 免疫程序 免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为100?g，第二次为50?g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06-1×107。 检测方法的建立及免疫效果的评价 A：建立成熟的检测方法是关键，一般有以下几种方法： ELISA IPMA 免疫荧光 B：免疫效果的评价 一般于三免疫后一周，通过尾静脉采血检测抗体产生情况，一般以稀释1000倍仍为阳性判为免疫成功。 杂交瘤细胞株的建立 SP2/0细胞的准备 饲养层细胞的制备 免疫脾细胞的制备 融合 阳性杂交瘤的筛选 细胞的冻存与复苏 单克隆抗体的制备 SP2/0细胞的准备 SP2/0细胞在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。 融合前24-48 h将SP2/0细胞分瓶扩大培养，融合前6 h，弃去瓶中培养液，换上新液。 融合时，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于15 mL离心管内，1000 rpm离心5 min，用5 mL无血清的1640悬浮沉淀，再离心一次，然后用无血清的1640培养液重新悬浮，细胞计数，取107细胞悬液备用。 饲养层细胞的制备 融合前一天制备饲养细胞，一般选用8周龄Balb/C小鼠腹腔巨噬细胞，步骤如下： 将Balb/C小鼠摘除眼球采血（留做阴性对照），然后拉颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。 用无菌剪刀剪开皮肤，用无菌镊子撕开皮肤，暴露腹膜。 用5mL无菌注射器吸取5mL HAT选择培养液注入到小鼠腹腔中（严禁刺破肠管），注射器不拔出，然后用无菌镊子轻轻触动几次左右两侧腹膜，吸出营养液。 重复1次上步操作，补足20mL HAT选择培养液，混匀后加入2块96孔板，100μL/孔，放入37℃ CO2培养箱培养。（此为经验操作，标准操作要进行细胞计数，浓度为1×105/mL；如果做2块饲养细胞，吹两次即可，如果做3块则加吹一次） 免疫脾细胞的制备 加强免疫3-5天后小鼠眼球采血（作为阳性对照，尽量多的采血，否则脾中红细胞较多，影响融合），然后拉颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。 用无菌剪刀剪开皮肤，无菌镊子撕开皮肤，暴露腹膜；再用无菌剪刀剪开腹膜，暴露脾脏；无菌取脾脏，无血清1640洗一次，去除结缔组织；无菌注射器吸取1640培养液，将脾细胞吹出；1000rpm离心5min，细胞用1640培养液洗1次，细胞计数，取5×107-1×108脾细胞悬液备用。 融 合 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10-1：5的比例混合在一起，在15mL离心管中用无血清1640洗1次，离心，1000rpm,5min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响PEG浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。 60s内加入37℃预温的1mL 50%PEG溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴静置作用90s。 加37℃预温的1640培养液以终止PEG作用，首先，1 min加入1 mL，然后在5 min内缓慢加入10mL，终止后置于37℃作用5min。 离心，800rpm, 5min。 弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动，用40mL含HAT选择培养液轻轻重悬。 将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μL。一般一个免疫脾脏可接种4-6块96孔板。 将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。 融合过程中注意事项 SP2/0细胞与免疫脾细胞数比例适当。 两种细胞要处于较好的状态，吹吸细胞时要轻柔。 PEG融合之后，加营养液中和时要缓慢，以免将破坏融合细胞。 阳性杂交瘤的筛选 杂交瘤细胞长到孔底1/5-1/10时可以进行检测，一般情况下10d即可；还可以当营养液发黄时检测。 取样：无菌取杂交瘤培养上清，然后在原孔中加入HT培养液。 应用已经建立起的检测方法筛选阳性孔，以制备PCV2-Cap单抗为例： 用重组PCV2-Cap蛋白和野生型杆状病毒包被ELISA板进行平行检测，每孔加入50μL杂交瘤细胞培养上清液（如果同时检测项目繁多，可