7电泳技术讲解.pptVIP

(一)不连续聚丙烯酰胺凝胶盘(板)状电泳 缓冲液 浓缩胶 分离胶 B.电荷效应 蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 (一)不连续聚丙烯酰胺凝胶盘(板)状电泳 C.分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 (二)连续密度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 优点： 1.具有使样品中各个组分浓缩的作用。 2.可提供更清晰的谱带，适于纯度鉴定。 3.可在一张胶片上同时测定分子质量分布范围相当大的多种蛋白质的分子质量。 4.可以测定天然状态蛋白质的分子质量。 垂直板 (二)连续密度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳  (三)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 用还原剂(巯基乙醇等)和十二烷基硫酸钠处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，并且1g蛋白质可定量结合1.4gSDS,亚基的构象呈长椭圆棒状。由于与蛋白质结合的SDS呈解离状态，使蛋白质亚基上带有大量大量负电荷，其数值大大超过蛋白质原有的电荷量，掩盖了不同亚基间原有的电荷差异。各种蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，电泳时纯粹按亚基大小靠凝胶的分子筛效应进行分离。有效迁移率与分子质量的对数成很好的线性关系。 垂直板 (四)等电聚焦电泳 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing，简称IEF)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 (四)等电聚焦电泳 两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 (四)等电聚焦电泳 (四)等电聚焦电泳(五)双向凝胶电泳 (四)等电聚焦电泳(五)双向凝胶电泳 (六)毛细管电泳 HV = High Voltage (六)毛细管电泳 Electrophoresis without support, in narrow-bore tubing (~50 μ ID/inner diameter) Movement of sample is through buffer in high voltage electric field Migration of given molecule is determined by parameters of setup and properties of molecule: t = L2/μV where t is migration time, L is capillary length, μ is mobility of molecule, V is applied voltage Resolution is affected by properties of molecule: N = μV/D where N is number of theoretical plates and D is diffusion constant of molecule (六)毛细管电泳 应用 Separation of small or large molecules (amino acids, nucleotides, peptides, proteins, nucleic acids, etc.) Separation of DNA synthesis products Oligonucleotide synthesis quality control Automated DNA sequence determination 毛细管电泳 (七)交变电场凝胶电泳 分离大分子DNA 六、电泳相关方法 (一)电泳染色技术 (二)凝胶干燥技术 (三)凝胶扫描技术 (四)凝胶成像