荧光PCR原理及应用课件.ppt

深圳匹基生物技术开发有限公司技术支持部 新药试生产转正式生产批件 乙型肝炎病毒（HBV） 核酸扩增（PCR） 荧光定量检测 试剂盒 国药准字PCR---DNA体外复制 PCR——信号放大 PCR的特点 高灵敏度 高特异性 简便快捷 定量原理和方法 原理：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 外标法：将几个已知拷贝数的纯化的目的基因标准品进行FQ-PCR扩增，绘制荧光定量标准曲线。 内标法：将已知浓度的内标基因加到各标本中，与标本一起经历核酸提取、加样、逆转录、PCR扩增及信号检测的全过程，比较内标最后的实测值与已知值，以检验标本中是否存在抑制PCR的因素，也可对样品的拷贝数加以校正。 荧光PCR定量的原理-外标法 标准曲线→定量 荧光定量PCR的临床应用 早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证 输血源的筛选 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 疾病的早期诊断 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。 HBV DNA与血清免疫学的关系 HBV DNA 与HBsAg/ HBsAb的关系HBsAg（+）HBV DNA（-）：病毒基因的整合，此时只能表达HBsAg，而没有DNA的复制；操作失误；PCR试剂的灵敏度不够。HBsAg（-）HBV DNA（+）：“窗口期”；HBsAg 的水平过低无法检出，或者HBsAg确已消失但病毒仍处于低水平复制状态；暴发性乙肝以合成HBcAg 为主，很少或不合成HBsAg；S区基因发生逃避免疫变异造成HBsAg阴性而HBV DNA阳性；血清亚型的漏检；老年人HBsAg检出率低于5%，HBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有报道HBsAb出现后血清内仍有DNA复制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb与HBV DNA同时阳性，但通常HBV DNA检出率逐步下降 HBV DNA 与HBeAg/ HBeAb的关系HBeAg阳性与HBV DNA有显著相关。HBeAg 阴转往往是HBV病毒血症的消失或炎症的静息。通常认为HBeAg转阴继而出现HBe抗体的转化为乙型慢性肝炎好转稳定的标志。事实上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg阴转并不意味着炎症活动的停止。HBeAg阴性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表达为主，感染起始即为HBeAg阴性。 如HBV： 根据《2000年拉米夫定临床应用指导意见》，中国慢性乙肝病人治疗的主要目的就是降低血清HBV DNA，诱导HBeAg血清转换等。 HIV: 目前用于治疗艾滋病的药物中主要就是抗病毒类药物，因此，HIV RNA滴度的定量测定与抗HIV药物治疗及疗效有着直接的关系。 病情评估和预后判断 通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。 遗传疾病的早期诊断 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。 肿瘤的诊断 荧光PCR的作用： 可对原癌基因的突变和易位等作出检测。 可对原癌基因的mRNA进行定量分析。 有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。 探索癌变发生机理的研究提供参考。 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。 结核病及性病等核酸检测意义 病原体的检测在临床上通常采用镜检、培养等方法。镜检法操作简便，易造成假阳性结果，同时灵敏度较低。 培养方法要求高，耗时，不利于临床上的及时诊断和用药。 荧光PCR方法具高灵敏度，速度快。不能培养PCR是唯一确诊手段（例如HPV） PCR污染及预防对策 污染原因 标本间交叉污染 PCR试剂的污染 PCR扩增产物污染 气溶胶污染 实验室中克隆质粒的污染 污染的监测 对照试验 试剂空白对照阳性对照 阴性对照 重复性试验 PCR防污染措施 实验环境的控制PCR应实行严格的分区操作：前准备区；样本处理区，其中DNA和RNA的处理也应该分开；扩增区。各区专区使用，并尽量使用一次性消耗品，高压消毒，实验器械和台面均应进行定期消毒等。 2．避免PCR后处理荧光PCR不同于其他的PCR方法，无须对PCR扩增产物进行任何的检