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基因载体聚合物研究药剂学论文 非病毒基因载体聚合物以其低毒、低免疫原及靶向性等优点正成为目前基因治疗的热点之一。基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达从而达到治疗目的的方法,优良的基因传递系统要能包裹并保护核酸物质,避免内涵体降解,并能专一靶向机体的靶器官。载体问题一直是基因治疗研究领域的核心技术之一,基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒等[1],其优点是病原性低、转染率高,但其不仅价格昂贵,且易引发机体强烈的免疫反应并可能致癌,尤其是安全性低的缺点限制了其在临床的应用。非病毒载体的种类很多,如阳离子聚合物、阳离子多肽和阳离子脂质体等[2],具有价格低、制备简单、安全有效、无免疫原性等优点,已渐成为病毒类基因载体的替代者。本文从药剂学的角度综述近年来非病毒基因载体聚合物的研究现状,并探讨如何优化非病毒基因载体聚合物传递体系以提高基因治疗的疗效。 1　非病毒基因载体的种类 1. 1　脂质体或脂质复合物 脂质体包括阳性、中性和阴性脂质体,其中阳性脂质体研究的最为广泛。自从1987年以来,众多学者相继合成出许多阳离子脂质体。所有的阳离子脂质体的一端皆拥有1~2条由12~18个碳原子组成的疏水链,使其在水性介质中形成双层结构,并包裹DNA;另一端为亲水性的N+,通过静电力与DNA结合以形成脂质复合物。构效关系研究表明[3],增加分子中N+数目以及N+与疏水链的距离,有利于基因转移。脂质体或脂质复合物经静脉注射后,很快被血浆清除并在肺组织中积蓄,蛋白质主要在肺内皮细胞中表达,通常表达时间较短,一般在给药后4~24 h即达峰, 1周后消失。因此,阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位以避免静脉给药选择性差的缺点。有研究表明[4],气管内给予野生型Ad-p53凋亡诱导基因可促使肺泡上皮细胞中的半乳糖苷酶基因的表达使早期肺部肿瘤缩小,并且可有效地防止脂质复合物中DNA的降解。目前虽然在阳离子脂质体构效关系研究的基础上,合成了一些新的脂质载体,但离理想的脂质载体还相距较远,其主要困难在于体内外转染条件的差别,而且转染效果还取决于给药途径。因此,只有根据实际的临床应用来个性化设计才能获得较为理想的载体,这无疑给载体的开发带来困难。脂质体或脂质复合物并没有长期安全性报道。有动物实验表明[5],脂质体或脂质复合物是无毒的,而且若给予小剂量,其诱导的炎症反应很小;但当小鼠呼吸道吸入脂质复合物后,可诱导产生剂量依赖性的肺部炎症反应并伴随细胞因子的产生;若静脉注射给予DNA阳离子脂质复合物,则发现可激发细胞因子如INF和TNF产生。这些细胞因子不仅引发毒性,还抑制外源基因的表达,影响疗效。 1. 2　阳离子多聚物 1. 2. 1　多聚赖氨酸　聚-L-赖氨酸和去唾液酸糖蛋白连接的聚合物用于细胞的基因靶向转移,其基因转染效果较阳离子脂质体差。有研究表明[6],在有或无靶向配体的情况下,多聚赖氨酸与DNA的聚合物的细胞摄取率和基因转染率都依赖于聚合复合物正电性的存在。而将组氨酸连接到聚-L-赖氨酸的残基上形成的聚合物比添加了氯喹的聚-L-赖氨酸混合物更为有效,这可能是由于在pH6的情况下,质子化的组氨酸提供了额外的内吞缓冲能力,因此,组氨酸的使用有助于避免DNA在吞噬细胞中被降解。此外,用半胱氨酸和色氨酸残基替代聚-L-赖氨酸中的一些氨基酸残基,会增强polyplexes的基因转染率,这说明DNA的释放可能受细胞内二巯键的还原所激发。虽然多聚赖氨酸像脂质体一样能阻止血清中核酶对DNA的降解,但若经静脉注射给药,聚合物与血浆蛋白结合后仍将迅速从血浆中被清除。 1. 2. 2　聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)　PEI阳离子聚合物表面的正电荷与DNA上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成复合物。电镜观察显示[7],复合物中的多数质粒DNA分子浓缩为孤立的环状结构, DNA的二级及三级结构发生了改变,但一级结构无变化,仍保留转录活性。这种复合物的超分子结构可以描述为一种核-壳结构,疏水核是部分中和的DNA,外壳则是亲水的阳离子聚合物链段。这种核-壳结构,增加了体系在血液循环中的稳定性,保护DNA在传递过程中不受DNA酶或巨噬细胞的降解。PEI阳离子聚合物由于其自身具有缓冲容量,在不需要加入吞噬细胞或溶酶体溶解剂的情况下就显示出较好的基因转染效果。PEI也具有细胞毒性作用,其毒性与相对分子质量(Mr)有关,不同Mr或异构体的PEI,在体内基因转染的效果和毒性不同[8]。目前,PEI已用于不同给药途径的基因转移如吸入、肾动脉内给药、脑内注射和静脉注射,如