第二章DNA重组克隆的单元操作第五周解析.ppt

第二章 DNA重组克隆的单元操作 2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 2.4.2.2 菌落原位杂交法 操作过程：噬菌斑→原位影印→标记好的探针与膜杂交→置X光片放射自显影→曝光→有信号的可能为阳性克隆。 原理：依赖探针DNA与目标DNA之间的互补配对 2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 2.4.2.1 PCR鉴定 重组子和非重组子、期望重组子和非期望重组子 按照标记物，可将探针分为两种： 放射性探针（放射自显影方法进行检测） 非放射性探针 生物素：将生物素偶联在单脱氧核糖核苷酸分子上，合成探针，用偶联了荧光标记的抗生物素的蛋白进行检测 辣根过氧化物酶：用化学发光方法，通过感光胶片和显影技术来进行检测 探针标记的方法 随机引物方法 5-磷酸标记法 反转录标记法（PCR标记） 缺口平移标记 ABC标记 探针的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 用于编码特定表达产物的基因的寡核苷酸探针 某些基因编码的蛋白质的性质已知 通过氨基酸序列反推核苷酸序列 TGG-GAT/C-GAA/G-AAT/C-AAT/C-ATG 进行至少两轮的筛选才能获得阳性的克隆 探针的来源-同源序列 用不同来源的DNA分子制备成探针进行检测。 如：用来自鼠的基因A去检测人类中基因A 或基因家族中成员A去检测成员B 2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴