抑制端粒保护蛋白TPP1表达诱导ATM依赖DNA损伤反应医药学论文.docVIP

抑制端粒保护蛋白TPP1表达诱导ATM依赖DNA损伤反应医药学论文 作者：郭晓兰，袁国华，周京国，唐中，刘宁涛，杨明辉，青玉凤，吴凤霞，朱道银 【摘要】目的：构建端粒保护蛋白TPP1短发夹RNA表达载体，探讨抑制TPP1表达后对端粒DNA损伤及细胞增殖的影响.方法：体外构建端粒保护蛋白TPP1shRNA逆转录病毒表达载体shTPP101，shTPP102，与表达外源性TPP1的TPP1HA质粒共同转染293T细胞，WesternBlot检测shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表达；RTPCR检测shTPP1抑制小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）内源性TPP1mRNA的表达.再用shTPP1分别感染ATM＋/＋MEF和ATM－/－MEF细胞后，分别采用细胞生长曲线和BrdU掺入法检测细胞增殖，免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交法（IF/PNAFISH）检测端粒功能障碍诱导损伤灶（TIF）的形成.结果:shTPP101和shTPP102均能明显抑制外源性TPP1蛋白和内源性TPP1mRNA的表达，shTPP101和shTPP102作用于原代培养的MEFs后细胞生长缓慢，BrdU阳性细胞数量分别占8.0%和8.7%，显著低于对照细胞的29.3%(P0.01,P0.01)；而细胞表现为体积变大，形态扁平等类似细胞衰老的形态学改变；IF/PNAFISH法检测结果显示，shTPP1作用于ATM＋/＋MEF细胞后导致端粒DNA损伤标志物-磷酸化的H2AX（γH2AX）和53BP1损伤灶（TIF）的形成，定量结果显示约50%的ATM+/+细胞中出现至少5个TIF；而在shTPP1作用后的ATM-/-细胞中，端粒γH2AX和53BP1形成的TIF数量显著减少，出现5个TIF的细胞数量不足5%，与对照组细胞相比无显著性差异.结论：抑制TPP1表达后诱发端粒ATM依赖的DNA损伤反应，进而抑制细胞增殖，促进细胞衰老. 【关键词】端粒;短发夹RNA;DNA;损伤反应 0引言 端粒位于真核细胞染色体的末端，由串联重复的DNA和端粒结合蛋白组成，其主要功能是保持染色体的完整性，同时也是细胞生存期限的关键调控因子［1］.对肿瘤的研究发现，大多数肿瘤细胞在分裂增殖过程中保持稳定的端粒长度，因而通过干涉端粒的结构和功能有可能控制肿瘤发展［2］.目前发现端粒保护蛋白主要有6个亚单位：TRF1，TRF2，TIN2，Rap1，POT1和TPP1，他们共同组成端粒保护蛋白复合体（Shelterin）［3］，其中TPP1是形成蛋白复合体的关键因子之一［4-5］.我们通过采用靶向端粒结合蛋白TPP1小片段干扰RNA（siRNA）技术，构建TPP1短发夹RNA（shRNA）逆转录病毒介导的表达载体，观察抑制TPP1表达后所诱导的端粒DNA损伤反应以及对细胞增殖和衰老的影响. 1材料和方法 1.1材料构建TPP1的shRNA寡核苷酸和PCR引物由美国Sigma公司合成；RNA提取试剂盒、RTPCR反应试剂盒、转染试剂lipofectamine（Invitrogen公司）；限制性内切酶Bgl,EcoRⅠ,HindⅢ（Biolabs公司）；γH2AX鼠mAb（美国Upstate公司）；凝胶成像系统（美国AlphaInnotech公司）；PCR扩增仪PTC200EngineCycler（美国MJResearch公司）；BX41型显微镜（日本Olympus公司）. 1.2方法 1.2.1TPP1shRNA表达载体的构建小鼠TPP1的mRNA序列来自GenBank(GI，参照siRNA靶点设计原则，设计如表1.合成的正义链和反义链经变性和退火反应后形成双链DNA，用限制性内切酶Bgl和Hind将其定向克隆至逆转录病毒载体RetropSuper（含有嘌呤霉素抗性筛选标记），经EcoR和Hind酶切鉴定得到的阳性克隆RetropSupershTPP1，简称shTPP1.表1shTPP101和shTPP102的碱基序列 1.2.2细胞培养和转染将质粒shTPP101和shTPP102分别转染病毒包装细胞293T，转染操作按lipofectaminePlus说明进行：接种1×105个293T细胞于10cm细胞培养盘中，37，50mL/LCO2培养过夜；更换为无血清DMEM，逐滴加入转染试剂Lipofectamine（含4μgshTPP1质粒DNA），培养4～6h后，更换为完全DMEM培养基培养；分别于培养24，48h后收集293T细胞培养上清感染MEF细胞，72h后加入2mg/L嘌呤霉素进行筛选. 1.2