第六章I_目的基因与载体的连接解析.ppt

徐师大屈艾老师制作 屈艾制作 * 能具有调控机能的目的基因置于报告基因的 适当位置。 3、若某一目的基因可能有增强子作用，则应在报告基因 的适当部位设计一个插入位点，以插入一个功能基因，并由此来反映增强子的作用。 徐师大屈艾老师制作 屈艾制作 * 二、简答题 1、在人工重组时，当目的基因DNA末端与载体末端不匹配时，必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。请说出末端转换的主要方法和转换使用的主要工具酶是什么？ 2、简要说明目的基因与载体DNA分子的5种连接方法。 徐师大屈艾老师制作 屈艾制作 * 屈艾制作 屈艾制作 * 第6章I 目的基因与载体 的连接（重组） * 一.基因重组—基因工程的核心 1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用. 基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因．将两者连接起来，将目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩增或正确表达。 * 2、连接前的准备： 依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是： 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白至关重要。 (2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可能 * 具有调控机能的目的基因置于报告基因的上游适当位置。 若调控基因可能有增强子（其特点一是位置变化大、二是其作用无明显方向性）作用，还应在报告基因下游适当部位设计一个插入位点，以插入一个功能基因，由此反映增强子的作用。 * 插入功能基因 的位点 转录 起始 点 启动子 操纵子 表达 调控 报告基因 目的 机能 基因 基因 5’ 3’ * 二、连接前的处理 为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互相连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子.载体DNA