基因工程第十一讲()重组体导入受体细胞的原理与技术资料.ppt

重组体导入受体细胞的原理与技术 1 受体细胞(receptor cell) 1.2 作为基因工程的受体细胞必须具备的特性 便于重组DNA分子的导入； 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 便于重组体的筛选； 遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长； 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染； 有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。 1.3 基因工程中常用的受体细胞类型 1.3.1 原核生物细胞 1.3.2 真核生物细胞 1.3.1 原核生物细胞 作为受体细胞的优点： ①大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。 ②没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 ③原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 ④基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。 缺点： ①原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。 ②原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。 ③原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。 至今被用作受体菌的原核生物有 大肠杆菌 枯草杆菌 蓝细菌 ⑴大肠杆菌受体细胞 大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。 优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。 缺点：大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。 ⑵枯草杆菌受体细胞 是一类革兰氏阳性菌 优点： ① 能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。 ②不产生内毒素，无致病性。 ③易于保存和培养。 ④具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。 应用： 已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。 ⑶蓝细菌（蓝藻） 作为基因工程菌的特点： 光能自养型生物，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。 1.3.2 真核生物细胞 ⑴真菌受体细胞 真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。 酵母菌细胞 是单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统。 优点： ①酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对比较简单。 ②具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。 ③不含有特异性病毒，不产生毒素。 ④培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。 ⑤能使外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工。 ⑵植物受体细胞 优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。 缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。 现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。 ⑶动物受体细胞 目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。 常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。 2 重组DNA分子转入原核生物细胞 例子：重组DNA