论RASSF1A基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响.docVIP

论RASSF1A基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响 摘要：　目的：研究RASSF1A提高肝癌细胞化疗药物敏感性的作用。方法：通过脂质体介导的基因转染法将RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染肝癌细胞株QGY-7703，G418筛选稳定表达株，并以RT-PCR和Western Blot进行鉴定目的基因的表达。化疗药物阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)分别作用各细胞株后，检测各细胞株的生长抑制率。结果：经800 μg/ml 的G418最佳筛选浓度筛选QGY-7703细胞株，成功建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。以QGY-7703细胞为对照，MMC对表达RASSF1A基因的肝癌细胞的生长抑制率最大为21%。结论：RASSF1A基因的表达可明显提高肝癌细胞对MMC的敏感性。RASSF1A的表达不影响肝癌细胞QGY-7703对ADM、 VP-16、5-FU和DDP敏感性。 关键词： 肝细胞癌 Ras association domain family 1A 药物敏感性 逆转录聚合酶链反应 RASSF1A基因是近年来发现的一个重要的抑癌基因，其抑制肺癌、肾癌、膀胱癌细胞生长的功能已得到证实[1~3]。通过瞬时转染发现，RASSF1A基因的表达使肺癌细胞株NCI-H1299生长阻止在G1/S期与抑制细胞周期蛋白cyclin D1的表达累积有关[4，5]。但对于RASS-F1A基因的表达对化疗药物敏感性的研究国内外尚未见报道，本研究通过建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株，观察RASSF1A基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响。 　　1 材料和方法 　　1．1 质粒、细胞株及主要试剂 pcDNA3.1(+)RASSF1A质粒由美国Pfeifer博士惠赠[1]。真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司，肝癌细胞株QGY-7703由国家人类基因组南方研究中心常规保存，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。所有细胞均在37.0 、5%CO2及饱和湿度的培养箱内培养。脂质体Lipofectamine 2000、G418、Trizol RNA抽提试剂、二抗羊抗鼠IgG-HRP均购自Gibco公司；一抗鼠抗人RASSF1A单克隆抗体购自eBioscience公司；RNA逆转录酶SuperScript reverse transcriptase购自 Clothe公司； Cell Titer 96（R） AQueous Non-Radioative Cell Proliferation Assay试剂盒购自Progema公司。 　　1．2 G418对肝癌细胞株的毒性试验 各细胞株按1×105/孔接种于6孔板，细胞贴壁后，按0、200、400、600、800、1000 μg/ml 的G418浓度加入相应培养基，每周换液2次，2周后弃培养基。 　　1．3 稳定表达株的建立 严格参照Lipofectamine 2000说明书，将纯化的质粒pcDNA3.1(+)RASSF1A（经测序鉴定）及 pcDNA3.1(+)各2 μg转染对数生长期的QGY-7703，转染后20 h换新鲜培养基，48 h后以1︰10稀释传代培养，72 h后按相应浓度的G418进行筛选。待转染细胞呈小克隆生长时，用Disco 纸片将G418抗性细胞克隆依次转到96孔板、24孔板、6孔板或35 mm培养皿中扩大培养。收集细胞蛋白，RT-PCR和Western Blot鉴定是否有目的基因的表达，并将阳性细胞克隆冻存备用。 　　1．4 RT-PCR Trizol法提取各组细胞的总RNA，逆转录反应使用随机引物OligdT18合成第一链(严格按照厂家说明书进行)。RASSF1A引物序列 　　R1：5′-GATGAAGCCTGTGTAAGAACCGTCCT-3′， 　　R2：5′-CAGATTG-CAAGTTCACCTGCCACTA-3′， 　　扩增产物为245 bp；内参照β-actin, 　　β1:5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’， 　　β2:5’- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′， 　　扩增产物为 300 bp。退火温度均为58 ；PCR产物于2.0%琼脂糖凝胶电泳。 　　1．5 Western Blot 取40 μg 细胞裂解液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白电转至PVDF膜上，固定封闭后，依次与一抗、二抗结合，增强化学发光法（ECL）显色后暗室显影。 　1．6 药物敏感性实验（药物