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论核转录因子κB抑制因子对中性粒细胞凋亡的影响 摘要： 目的 探讨脂多糖(LPS)刺激下核转录因子κB（NFκB）抑制因子（IκBα）对中性粒细胞凋亡的影响。方法 离体培养人中性粒细胞，分为生理盐水对照组（A组）、来普霉素B（LMB）干预组（B组）、LPS刺激组（C组）和LMB +LPS组（D组）。各组分别在刺激后120 min ，用 Western印迹检测细胞核、胞浆中IκBα含量，用NFκBp65试剂盒检测细胞核NFκB活性，流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡百分比。结果 C组胞浆及胞核中IκBα含量较A组中明显减少，而NFκB活性显著增加，中性粒细胞凋亡比例减少；D组胞核中IκBα含量较C组中明显增多， NFκB活性明显抑制，中性粒细胞凋亡比例增加。结论 IκBα的核内聚集可抑制NFκB活性，并促进炎症状态下中性粒细胞凋亡。 关键词： 核转录因子κB;核转录因子κB抑制因子;中性粒细胞;凋亡 　　急性肺损伤、急性胰腺炎等炎症反应过程中，中性粒细胞首先浸润于炎症灶中，并可能过度活化导致全身炎症反应综合征〔1〕。核转录因子κB（NFκB）作为多种介质的转录调控因子，不仅参与炎症介质的调控，同时也对中性粒细胞凋亡基因的表达调控有重要作用。因此，NFκB自身的活性状况对炎症进程有至关重要的作用。本研究通过脂多糖(LPS)刺激中性粒细胞，探讨NFκB天然抑制调节因子IκBα对中性粒细胞凋亡的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　LPS、来普霉素B（leptomycin B，LMB）购自深圳晶美生物公司，IκBα单抗、Western印迹试剂盒购自武汉博士德公司,Trans AMTM NFκBp65 kit 为大连宝生物公司产品。细胞核浆蛋白制备试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。 　　1.2 中性粒细胞分离培养及细胞核、浆蛋白制备 　　2 w内未服用药物的健康成人志愿者（为献血员），参照文献〔2〕进行中性粒细胞分离纯化。纯化后的细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640溶液中至终浓度为5×109/L,于37振荡培养。将离体培养的中性粒细胞分为4组：（1）生理盐水对照组（A组）；（2）LMB干预组（B组）；（3）LPS刺激组（C组）；LMB+LPS组（D组）。LPS刺激的终浓度为0.1 g/L；LMB+LPS组中，予LPS刺激前45 min加入1‰（V/V）LMB。应用北京博奥森生物技术有限公司细胞核浆蛋白制备试剂盒提取核浆蛋白，步骤参照说明书进行。应用Bradford法测定制备蛋白浓度。 　　1.3 细胞核NFκB活性检测 　　采用Trans AMTM NFκBp65 试剂盒进行检测。以不加入核提取物为空白对照，实验组中每个时相点进行5次测定，读取分光光度计450 nm处A值进行统计学处理。 　　1.4 细胞核、浆IκBα含量检测 　　将提取的各组细胞核、浆蛋白进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDSPAGE）蛋白电泳。上样量20 μg，90 V电泳2 h后，电转至硝酸纤维素膜。5%（W/V）脱脂奶粉封闭1h,加入兔抗IκBα多克隆抗体（1200）4过夜，羊抗兔抗（15 000）室温下孵育1 h。应用化学发光试剂盒进行检测，凝胶图像分析系统扫描分析，并用测得目的条带的灰度×面积表示结果。 　　1.5 中性粒细胞凋亡的检测 　　采用流式细胞仪DNA倍体分析法：收集1×105个中性粒细胞，1 000 r/min离心5 min,弃培养液，用PBS液洗2次后加入70%冷乙醇2 ml混匀，4固定30 min。再以1 000 r/min离心5 min,弃培养液，用PBS洗2次后加入1 ml碘化丙啶（PI）染色，4孵育30 min，上机分析。 　　1.6 统计学处理 　　以SPSS10.0软件进行统计分析，以x±s表示，进行t检验。 　　2 结 果 　　2.1 细胞核NFκB活性检测结果 　　LMB干预组细胞核NFκB活性(0.041 2±0.003 1)与对照组(0.042 1±0.003 3)比较，差异无统计学意义(P0.05)。给予LPS刺激后，NFκB活性(0.622 0±0.053 6)较对照组显著增强(P＜0.05)；而给予LPS刺激的同时加入LMP，NFκB活性(0.050 0±0.003 6)明显受到抑制。 　　2.2 细胞核、浆IκBα含量检测结果 　　细胞核、浆IκBα Western印迹结果见图1。细胞核、浆IκBα凝胶图像扫描结果见表1。对照组、LMB干预组胞浆与胞核中IκBα含