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论高血糖对脑出血大鼠细胞凋亡及Bax表达的影响 摘要： 目的 探讨高血糖对大鼠脑血肿周围组织神经细胞凋亡和Bax表达的影响。方法 采用立体定向技术制作大鼠脑出血模型。96只雄性SD大鼠被随机分为4组：假手术组、正常血糖组、高血糖组及胰岛素干预组，各组分别于术后6 h、24 h、3 d、7 d 4个时间点取脑组织，应用免疫组化方法检测血肿周围组织Bax的表达情况，TUNEL法检测血肿周围神经细胞凋亡。结果 高血糖组大鼠脑血肿周围组织Bax的表达及细胞凋亡明显高于其他组(P0.01)，胰岛素干预组上述指标均低于高血糖组(P0.01)，而高于假手术组，与脑出血组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 高血糖能增加大鼠脑血肿周围组织神经细胞凋亡和Bax的表达，降糖治疗对脑神经细胞凋亡起保护作用。 关键词： 脑出血;Bax;高血糖;细胞凋亡;胰岛素 　　　脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是指原发性非外伤性脑实质内出血，占急性脑血管病的20%～30%，发病率为(60～80)人/(10万·年)，急性期病死率30%～40%。已有多项研究证实细胞凋亡是脑出血的继发性损伤机制之一。糖尿病是最严重的全球性问题之一，糖尿病能增加脑出血患者早期的死亡风险[1],同时也是其预后不良的因素[2]。本实验通过建立高血糖脑出血模型，采用免疫组化和TUNEL法研究高血糖对大鼠脑血肿周围组织神经细胞凋亡和Bax的表达的影响，为高血糖脑出血的治疗提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物和分组 成年雄性SD大鼠96只，体质量200～250 g,由郑州大学实验动物中心提供。按照随机化原则将实验动物分为4组：假手术组、正常血糖组、高血糖组以及胰岛素干预组。每组设4个时间点：6 h、24 h、72 h、7 d，每个时间点设6只大鼠。 　　1.2 主要仪器及试剂 江湾型立体定位仪、微量进样器、显微外科手术器械、牙科钻、罗氏血糖仪(德国罗氏诊断有限公司)、兔抗大鼠Bax多克隆抗体、SP系列二抗、DBA显色液(均购北京中杉生物技术有限公司)、TUNEL试剂盒(Sigema公司);Streptozotocin(STZ)(Sigema公司);普通胰岛素，每瓶400U(10ml)(江苏万邦生化医药股份有限公司)。 　　1.3 高血糖模型大鼠的建立 参照STZ诱导法制备高血糖大鼠模型[1]，以STZ 60 mg/kg，对高血糖及胰岛素干预组大鼠单次腹腔注射，注射后1周检测血糖≥11.1 mmol/L为成功模型。 　　1.4 大鼠尾状核脑出血模型、高血糖模型的建立 高血糖模型[3]成功后，胰岛素干预组腹壁皮下注射普通胰岛素，3次/d,4 U/次，将血糖控制在8.3 mmol/L以下，直至实验结束。注射参照Xue等[4]的方法，大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于立体定向仪，行顶部正中切口，调整立体定向仪使大鼠前囟和后囟在同一水平面，于前囟前0.2 mm，中线向右旁开3.0 mm处进针，深度5 mm，即尾状核位置。假手术组缓慢注入50 μl灭菌生理盐水，其余各组缓慢注入50 μl自体动脉血，动脉血采自股动脉，15 min注射完毕，留针10 min后缓慢缓慢退出，缝合皮肤。 　　1.5 标本及病理切片的制作 将各组大鼠在相应的时间点用过量的水合氯醛麻醉，迅速打开胸腔，经左心室插管，同时剪开右心耳，快速灌注灭菌生理盐水，直至由右心耳流出的液体变为清亮为止，继而灌注4%的多聚甲醛液200 ml，然后断头取脑，脑组织标本浸入4%的多聚甲醛液后固定48 h，以注射点为中心取厚约1 cm的冠状切片，石蜡包埋。冠状位上连续切片，片厚4 μm，分别行免疫组化和TUNEL染色。 　　1.6 图像采集分析 光学显微镜下，DBA染色阳性细胞染色呈棕黄色，利用德国Leica显微成像系统和上海山富科学有限公司Biosens Digital Imaging System图像分析软件，计算每组大鼠血肿周围Bax阳性细胞的平均积分光密度。TUNEL结果计算：凋亡阳性细胞的细胞核呈棕黄色，细胞出现黄至棕黄褐色颗粒。在装有目镜网格测微尺的400倍视野下随机计数血肿周围4个视野内的阳性细胞数及神经细胞，计算凋亡指数(凋亡细胞数/神经细胞×100%)。 　　1.7 统计学分析 各组实验组数据均用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，均数间的两两比较采用LSD检验，Bax与TUNEL的相关性采用直线相关分析，检验水准α=0.05。 　　2 结果 　　2.1 脑血肿周围组织Bax表