第四章目的基因的分离.讲解.pptVIP

第四章 目的基因的分离 教学要求： 掌握常用的目的基因制备方法 目的基因的分离基本原理及应用 原核生物基因的组成 真核生物基因的组成 真核生物基因的转录 结构基因 结构基因（Structural gene）是指一类不仅可转录成信使RNA（mRNA），而且可翻译成多肽链，从而构成各种结构蛋白质（包括催化各种生化反应的酶）的基因。 第一节 目的基因的制备 直接分离法 构建基因组文库分离法 构建cDNA基因文库分离法 聚合酶链式反应技术扩增目的基因 基因的化学合成 什么是基因？ 基因是指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位亦即一段具有功能性的DNA序列。 基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 目的基因 基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此，必须从现有的生物群体中，根据需要分离出用于克隆的此类基因。 通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片断，称为目的基因。 生物界的长期进化积累了大量对人类有用的基因，这是一个宝贵的资源。 2012年1月5日报道，美国诞生了首例转基因猴，它们的基因来自六个不同的胚胎。 一、直接分离法 限制性核酸内切酶酶切分离法 基因分离的物理化学法 “鸟枪法” 1、限制性核酸内切酶酶切分离法 适用于从简单的基因组中分离目的基因（例如质粒或病毒） 已定位：根据目的基因两侧的已知的酶切位点，一次就可以获得。 已定序：只需要用已知序列的限制性内切酶进行一次或者多次酶切，分离纯化所需的DNA片段，与适当载体连接。 未定序或无定位：也只需酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，然后钓出目的基因。 2、基因分离的物理化学法 基本原理是DNA分子的两条链存在着G≡C、A﹦T碱基配对，其中GC间存在着3个氢键，AT间存在着2个氢键。如果不同基因的碱基组成差异较大，其理化性质如浮力密度、解链温度等也有明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组分离目的基因的目的。 密度梯度离心法（富含GC的片段浮力密度大，使用精密的密度梯度超速离心技术） 单链酶解法（富含GC的片段Tm高） 分子杂交法（碱基互补配对）　 3、“鸟枪法”（Shotgun） 将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。 最初主要用于测定微生物基因组序列。后来，“生物鬼才”文特尔（Craig Venter）及其公司美国塞莱拉公司先后利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。 主要操作步骤： 使用多种限制性内切酶或超声波等方法将生物细胞染色体DNA切割成基因水平的许多片段 将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库 结合筛选的方法从众多的转化子中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离回收 将重叠的序列进行拼接，最终得到DNA序列 中国科学院2004年12月 9日在北京宣布，国际鸡基因组计划取得重大成果：利用经济、快速、高效的测序方法――“鸟枪法”，我国科学家不仅和国际同行共同绘制出以红原鸡为对象的鸡基因框架图谱，而且领衔绘制出了乌鸡、肉鸡、蛋鸡等四种不同鸡种之间的遗传差异图谱。 优点： 不需要高密度的图谱 速度快、简单、成本低 缺点： 拼接组装困难，尤其在重复序列多的区域 主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基因组 中国科学家的水稻基因组计划“提供了一个有关鸟枪测序法速度和效率的极好范例”。 二、构建基因组文库分离法 1、基因组 DNA 文库（genomic DNA library） 从生物组织细胞提取出全部 DNA，用物理方法或酶法将 DNA 降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组 DNA片段与载体连接的重组 DNA 分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各 DNA 片段克隆的集合体。 2、基本步骤 ①细胞染色体大分子DNA提取和大片段的制备； ②载体 DNA 的制备； ③载体与外源大片段的连接； ④体外包装及基因组 DNA 文库的扩增； ⑤重组 DNA的筛选和鉴定。 3、基因组 DNA 文库的特点 1975 年，Clarke 和Carbon提出计算重组子数目的公式： N=ln（1-P）/ ln（1-f） 式中，N 为所需的重组子的数目；f 为单个重组体中插入片段平均大小与基因组 DNA总量之比；P 为选出某一基因的概率（通常期望为 99%）。 以人?-珠蛋白基因为例，分子量约为1.5