第五章目的基因的获取讲解.pptVIP

未知基因的获得途径： ⒈构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因 2.构建cDNA文库，筛选目的基因 3.mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 4.酵母双杂交体内鉴定基因 本 章 内 容 第一节 基因组DNA的片断化第二节 基因的化学合成 第三节 目的基因的保存和扩增 第四节 目的基因的分离和扩增 第一节 基因组DNA的片断化 二、限制性内切酶消化法 一. 机械切割法 1. 优点 如果带有粘性末端，产物可以 直接与载体连接，连接效率高 ②消化的片断分子量太大或太小 第三节 目的基因的保存和扩增 文库：是指一种全体的集合。 通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。 克隆并不是为了保存，而是为了分离。 为什么要建基因文库？ 高等生物的基因组DNA十分复杂，单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常难的，必须构建基因文库，利用文库筛选技术获得该基因的阳性克隆，然后对其进行分析。 基因文库的分类 基因组文库：提取染色体基因组DNA。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列。 cDNA文库：mRNA反转录成的cDNA。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸序列，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列推导出来。 2. 载体选用 （1）λ噬菌体载体 （2）黏粒载体 最早用于基因克隆的载体。 只能容纳比质粒分子量更小的片段。 不能用于核基因组文库。 适合于短序列的克隆文库。叶绿体DNA文库、线粒体DNA文库、cDNA文库。 3. 基因组文库构建的一般步骤 （3）载体与基因组DNA大片段的连接 4. 基因组文库的大小 5. 基因组文库的扩增及保存 三、 cDNA文库的构建 3. 构建cDNA文库的一般步骤 （2）mRNA的分离纯化 （3）cDNA的合成 ② 降解mRNA模板 ③ cDNA第二链合成 ④去掉发卡结构 妙用RNaseH（置换合成法） （4）cDNA与载体连接： 4. cDNA文库的大小 cDNA文库构建的实例 mRNA cDNA 3’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目 N= ln (1-p) ln (1-f) p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数 N:所需的重组载体数（克隆数） 基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式： 例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片断 的平均长度如果是1.7×104 bp N= ln (1-p) ln (1-f) = ln (1-99%) ln (1-f) = 4.61× G f N= 4.61× G f G:Genome大小；f:fragment大小 N= 4.61× G f = 4.61× 3×109 1.7×104 = 8.1×105 （1）基因组文库的扩增 ① 液体培养增殖法 最简便 混合培养方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-80 ℃储存（加终浓度为25%的甘油） 缺点：由于细菌在液体中以混合群体的形式生长和不同克隆生长速率的差异，导致文库中某些特定的序列过多或过少。 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-80 ℃保存。 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。 384孔板 ② 影印滤膜培养法 失真最小，最麻烦 用包装后的噬菌体颗粒感染细菌，并让细菌在硝 酸纤维素膜上生长，然后将滤膜上的文库影印到其他滤膜上，以供筛选和低温（-80℃）保存。 ③制备已包装的转导性裂解物 适用于粘粒文库，转导性裂解物可以在低温下长期保存。 （2）基因组文库的保存 小包装，方便，避免反复冻融 噬菌体一类的基因文库：密封