第五章目的基因的获取扩增与检测及相关技术之获取电泳,PCR讲解.pptVIP

第五章 目的基因的获取、扩增 与检测及相关技术 1、物理化学方法 2、鸟枪法 3、化学合成法 4、基因文库 5、逆转录合成 6、 PCR技术 7、凝胶电泳 8、酵母双杂交系统 9、杂交技术 10、生物芯片 11、 DNA测序 第一节 目的基因的获取及相关技术 一、物理化学方法 二、鸟枪法 三、化学合成法 四、凝胶电泳 五、PCR技术 六、基因文库（基因组文库、cDNA文库） 七、逆转录合成 八、酵母双杂交系统 一、物理化学方法 双链DNA碱基配对原则： G≡C（3个氢键） A=T （2个氢键） DNA中GC含量高，热稳定性高，熔解温度（Tm值）高。 对GC含量高的基因，可适当控制温度使富含A=T区解链，富G≡C区仍维持双链，在利用S1核酸酶，切去单链部分，得到富含G≡C区的待分离基因。 海胆rDNA（核糖体DNA）基因的分离纯化就利用此法，其G≡C含量达63%。 二、鸟枪法 三、化学合成法 磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 固相合成法 四、凝胶电泳 1、定义与分类 2、琼脂糖凝胶电泳原理 3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素 4、琼脂糖凝胶电泳的应用◎ 1、定义与分类 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 凝胶电泳：用琼脂糖或聚丙烯酰胺等作为支持介质的（区带）电泳法称为凝胶电泳。 琼脂糖凝胶电泳：检测、分离核酸(DNA、RNA)； 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)：检测分离蛋白质与小分子核酸 基因工程中重点应用琼脂糖凝胶电泳。 ◎ 2、琼脂糖凝胶电泳原理 核酸带负电荷： 单链：A-p-T- p-C- p-G- p -T…… 双链： 琼脂糖凝胶是多孔状结构: ◎ 琼脂糖凝胶是多孔状结构 电泳装置 电泳结束后的染色： 可用溴化乙锭（EB）对核酸进行染色， EB可嵌入到DNA的碱基对间。 被染色后EB可在紫外光下（300nm）观察，发出荧光。肉眼可分辨出50～100ng核酸。 用仪器（如凝胶成像系统）可达10 ～20ng。 ◎ 3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素 （1）凝胶类型与浓度： 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链。 ●常熔点琼脂糖：在100℃左右时呈液态，当温度下降到45 ℃以下时，凝聚成束状的琼脂糖凝胶； ●低熔点琼脂糖（LMP）：熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min ◎ 凝胶浓度影响分辨率，琼脂糖凝胶电泳可用于0.1～60kb DNA片段的检测分离。 不同浓度的凝胶有各自的适用范围。 ◎ 不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围 3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素 （2）电压： 电压高，DNA迁移快。 一般采用低电压高浓度凝胶来提高分辨率。 ◎ 3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素 （3）电泳缓冲液： pH 8.0左右，离子强度 0.02～0.05 硼酸盐缓冲液（TBE）：缓冲能力大于TAE； 醋酸缓冲液（TAE）：对高分子量DNA， TAE分辨率高于TBE。 ◎ 电泳仪与电泳槽 电泳仪与电泳槽 4、琼脂糖凝胶电泳的应用 （1）分离获得目的基因； （2）检测DNA； （3）粗测DNA分子量大小。 ◎ 五、PCR技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）： 20世纪70年代，Khorana首先提出设想， 1983年，美国Cetus公司的Mullis等人创立该技术，并在8年后因此技术获得了诺贝尔奖。 PCR为分子生物学领域带来了一场重大变革。 1、PCR反应体系组成 2、PCR反应过程 3、应用 1、PCR反应体系组成 （1）作为模板的DNA，即DNA模板； （2）寡聚核苷酸引物，要求与被分离（扩增）的目的基因两条链各一端序列互补配对； （3）有热稳定性的DNA聚合酶，如TaqDNA聚合酶； （4）4种dNTP，N=A、G、C、T； （5）反应缓冲液，Tris.HCl（pH8.3），含Mg2+。 寡聚核苷酸引物核苷酸长度：15-30个核苷酸，G+C 45%-55%，Tm在55 ℃以上。 寡聚核苷酸引物核苷酸顺序的确定方法： ★网上基因数据库查询； ★由基因所编码的蛋白质氨基酸序列密码子反推。 2、PCR反应过程 （1）变性：将模板置于95℃的高温下，使双链DNA解链变成单链DNA； （2）退火：将反应体系的温度降至55 ℃左右，使一对引物分别与变性的两条模板链相配对； （3） 延伸：将反应体系的温度调到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。 如此反复进行30个循环，可扩增得到大量的目的基因，以