目的基因的制备解读.ppt

第五章 目的基因的制备 第一节 目的基因的制备 第二节 目的基因的分离 一 概 述 基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。 二 什么是目的基因 基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的基因。 如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因 、工业用酶等相关基因等。 一般来说，目的基因的制备战略分为两大类 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 第一节 目的基因的制备 1、直接法制备基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从cDNA文库中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的基因 1.1 限制性核酸内切酶酶切分离法 限制性内切酶酶切分离法适于从简单基因组（如质粒和病毒）中分离目的基因。 ①对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。 ②对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点，用适当的限制性内切酶切割，一次就可获得目的基因。 1.2.1 化学合成法的基本战略 1.2.1.2 补钉延长法 1.2.1.3 大片段酶促法 1.2.1.4 三种方法各有利弊 1.2.2 化学合成的单元操作 化学合成的单元操作 1.2.3 DNA化学合成的用途 第一节 目的基因的制备 1 直接法制备基因 2 从基因组文库中钓取目的基因 3 从cDNA文库中钓取目的基因 4 利用PCR直接扩增出目的基因 对于高等真核生物而言，基因组DNA庞大，组成结构复杂，存在间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，大多数基因难以直接分离得到。 为了解决这个难题，可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。 但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增,而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来。 2、从基因组文库中钓取目的基因 2.1基因文库的构建 2.1.1基因文库的基本概念 基因库(gene pool):特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库(gene library or gene bank):从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）一个受体菌的群体之中 , 这个群体即为这种生物的基因文库。 根据构建方法的不同，基因文库分为:基因组文库（含有全部基因）； cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 2.1.2 基因文库构建的材料来源 2.1.3 基因文库的完备性 基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示： 其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率， f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小 2.1.4基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 2.1.5基因文库的构建技术路线 ①材料的选择及基因组DNA的制备； ②载体的选择； ③载体与基因组DNA的限制性酶切； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的筛选和保存。 2.1.5.1 基因组DNA的制备 2.1.5.2 载体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。上述几种载体的最大装载量如下： 2.1.5.3 载体与基因组DNA的切割 2.1.5.4 载体与外源片段的连接（1） 连接酶 DNA连接酶；T4 DNA连接酶；E.coli DNA连接酶 它们都可以催化5’末端磷酸和3’末端羟基形成磷酸二酯键。 但由于T4 DNA连接酶既能连接粘性末端还能连接平末端，而E.coli DNA连接酶主要连接粘性末端，所以一