核酸的分离与提取资料.ppt

通知 核酸的分离与纯化 免疫研究室 白莎莎 baishasha@gzucm.edu.cn 主要内容 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 DNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 RNA的提取和纯化 主要内容 谢谢大家！ 通知 煮沸法 染色体DNA为大分子线性DNA，质粒DNA为共价闭合环状分子。 质粒DNA为染色体外DNA，其分离和纯化需要最大限度地减少细菌染色体DNA的污染。 基本原理是煮沸后，线性的染色体DNA变性，共价闭环质粒DNA再回到中性环境中可回复为自然状态。 变性的线性DNA与变性的蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的环状DNA则溶解于溶液中，即可通过离心进行分离。 细胞器DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 线粒体 叶绿体 利用物质密度的不同分离混合物的一种方法。 将带分离的混合物置于均匀介质（蔗糖）中，以一定速度进行离心，密度大的物质优先沉降，密度小的物质处于上层，从而进行分离。 差速离心结合SDS裂解法 小结 （一） DNA提取常见的问题 DNA降解 DNA样品不纯 DNA量少 RNA的提取与纯化 细胞中RNA的含量 一般原则 RNA的分离纯化的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。 尽力抑制内源性RNA酶的活力，主要来源于样品中的组织细胞。 尽力避免外源RNA酶的污染，主要来于操作者的手、实验的器皿和试剂。 注意事项 RNA酶抑制剂 DEPC（焦碳酸二乙酯）和肝素。 异硫氰酸胍，目前认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。 RNA酶的特异抑制剂 （1）RNA酶阻抑蛋白(RNasin)是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白，可与RNA酶结合，从而抑制其活性。 （2）氧钒核糖核苷复合物是由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合后，几乎可完全抑制RNA酶的活性。 其它如酚、氯仿和去污剂(如SDS)、蛋白酶K、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。 小结 （二） RNA提取常见的问题 RNA样品不纯 核酸的分离与纯化 核酸的分离与纯化 周联老师因公出差，下周五（4.6日）《分子生物学》课停上一次，原定内容与4.13日内容合上。请大家谅解！ 请大家相互通知！！ 核酸是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的基本操作时分子生物学研究中最基本、最重要的技术之一。 核酸的基本操作包括核酸的分离和纯化、检测和保存、凝胶电泳、分子杂交等。 主要介绍核酸的分离和纯化相关内容 DNA的提取与纯化 RNA的提取与纯化 DNA的提取与纯化 理化特性 核酸都是极性化合物，都微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。核酸溶于10 %左右的氯化钠溶液，但在50 %左右的酒精溶液中溶解度很小。核酸的提取时常利用这些性质。 一般原则 保持核酸结构的完整性，即保持核酸的天然状态。防止核酸酶的降解。 防止其他物质的污染：蛋白酶、金属离子、有机溶剂、多糖等。 防止化学因素（酸、碱或有机溶剂）及物理因素（机械剪切或高温）引起核酸变性和破坏。 注意事项 1．尽量简化操作步骤，缩短提取过程，减少对核酸的破坏。 2．避免过酸、过碱等化学因素对核酸的降解。（pH 4-10） 3．减少物理因素对核酸的降解。主要是避免机械剪切力和高温。常规操作温度为0℃-4℃。 4．防止核酸的生物降解。 主要步骤 1．破碎细胞。 2．去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等生物大分子。 3．去除其它不需要的核酸分子。 4．沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂