16S rRN基因荧光定量PCR-基因芯片杂交法的建立及其应用研究.pdfVIP

2006浙江大学硕上学位沦文 16S rRNA基因荧光定量PCR一基因芯片杂交 技术的建立及其应用研究 浙江大学医学院 儿科学 硕士研究生 杨祖钦 导 师 尚世强主任医师 中文摘要 新生儿败血症(neonatalsepsis)发病隐匿，临床症状无特异性，存活着有相 ?11-一部分发生后遗症。因此，寻找快速、敏感而特异的新叫i儿败JIⅡ症早期诊断指 标，对指导临床治疗、降低新生儿死亡率、改善预后，具有|‘分重要的意义。在 本研究lh我们分析细菌16SrRNA箍冈序列，在其保守区设计引物和探针，进 rRNA基冈荧光定 行荧光定量PCR’j基因芯片杂交分析，最终建立了细菌16S 量PCR‘j牿冈芯片杂交相结合的方法快速检测细菌DNA，并埘临床标本进行检测 rRNA基因荧光定量PCR--恭 取得良好效果。本研究分二部分：第一部分，16S 冈芯片杂交技术的建立；筇二部分，16SrRNA犟闪荧光定量PCR--摹N；E片杂交 技术的临床应川研究。 第一部分 16S rRNA基因荧光定量PCR一基因芯片杂交技术的建立 方法：在细菌的16SrRNA基因保守区域设计通川引物，并在该引物的扩增的区 域内设定…条通川荧光探针。对阳性标准菌株组、阴性对照组进行荧)匕定量PCR 检测、分析。同时在细菌16rRNA基因保守区设计引物，设置区分革兰氏阴性菌、 阳性菌卜于其他特异性菌属的探针，制成基阕芯片，通过对标准菌株、阴性对照组 进行芯片荧光杂交、洗脱、扫描，最后进行分析。 2006浙江大学硕I二学位沦文 结果 阳性，其ct值在14．24～25．08之问。巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒，新型隐 球菌及白色念珠菌，人基因组DNA经上述方法检测均为阴性。即16SrRNA基因细 菌荧光定量PCR对细菌有高度的特异性，与人基因、真菌或病毒之问无交叉反应。 川质粒作为稀释滴度，在100～107 所测的ct值依次递增，最低可以检测到10个拷贝数，即相1j于2个细菌，其 Ct值为38．2；空白对照阴性，其Ct值为40。 2．对49株细菌PCR扩增后产物进行基网芯片杂交的结果：33株G+菌其G+ 探针和通用探针均阳性，G。探针阴性；16株G一葡-Ii，G。探针和通用探针均阳性， G+探针阴性，均能与相应特畀的探针发牛杂交，表明皋网芯片杂交不仪能区分 G+／G一菌并能明确细菌菌株。 结论 FQ—PeR检测灵敏皮高；耗时少；不受标本小存在抗菌药物或其他抑菌物质的 干扰：定量分析准确，有助于评价治疗效果、判断预后，有效解决了PCR污染问 题。幕阕芯片其杂交敏感性高，能检出特殊培养，难以培养等细菌；可检测任何 无菌体液，如血、脑脊液、胸水等；最快4d时检测，具有高迎量性，多干||I项广l 可‘次检测。此项复合方法可为细菌感染的早期、快速诊断提供新的有效手段。 第二部分 16S rRNA基因荧光定量PCR一基因芯片杂交技术的临床应 用研究 方法：本院新生儿、重症监护室(ICU)、15病区综合病房临床拟诊为化脓性脑 lml作脑脊液细菌培 膜炎的住院患儿标本49例，每例均抽取脑脊液2ml，其r|1 养，lml作细菌DNAFQ．PCR测定及芯片杂交。同时对临床疑为败血症的住院患 2006浙江大学硕上学位论文 。 FQ．PCR一基冈芯片杂交检