hpik3cashrna慢病毒载体构建及其抑制人舌鳞癌tca8113细胞的研究.pdfVIP

中山大学硕士论文 hPIK3c卜shRNA慢病毒载体构建及其抑制人舌鳞癌Tca8113细胞的实验研究 hPIK3CA—shI姒慢病毒载体构建及其抑制人舌鳞癌 Tca8113细胞的研究木 硕士研究生： 燕王翔 硕士生导师： 丁学强教授 专 业： 口腔临床医学 中文摘要 [背景与目的]口腔鳞状细胞癌(oral cell squamous 腔颌面部最多发的恶性肿瘤，发病率占口腔颌面部恶性肿瘤的80％以上。最近几 十年来，虽然以外科治疗、化疗、放疗技术为主的肿瘤综合治疗日臻成熟，但是 口腔鳞癌患者的长期生存率(5年生存率)以及肿瘤局部复发和远处转移的发生 率并无明显改善。 人类恶性肿瘤的发生发展过程中涉及到多种基因的表达和功能的异常。目前 多项研究已证实基因的异常表达在肿瘤的发生发展过程中起非常重要的作用，甚 至可以在某种意义上认为恶性肿瘤即为基因疾病。所以运用基因手段将是治疗恶 性肿瘤的希望。 通过心A调控基因表达的机制。siI矾A具有高度的序列特异性和强大的抑制基 因表达的效应。I斟m己被证明是极具潜力的基因治疗手段和研究基因功能的重 要工具，在基础和临床的研究中具有广泛的应用前景。 成、细胞的增殖、粘附、存活和迁移等相关，磷脂酰肌醇激酶一3催化亚单位Q 提示PI瞄CA在多种肿瘤中存在高频的细胞突变，是与多种肿瘤发生发展相关的 宰广东省科技计划项目N0．20078031500005，2005持 中山大学硕士论文 hPII【3c^一shRNA慢病毒载体构建及其抑制人舌鳞癌Tca8113细胞的实验研究 癌基因。所以PIl3cA可望作为肿瘤早期诊断和基因治疗的理想靶标。 基因治疗必须通过适当的基因转移技术将外源基因转移至特定细胞内。高效 的基因转移方法是基因治疗的关键和基础。逆转录病毒载体是目前基因治疗中应 用最广的载体，慢病毒载体与简单的逆转录病毒载体相比，具有转移基因片段容 量大、不易诱发宿主免疫反应、安全性较好、不仅能感染分裂细胞还能感染不分 裂细胞、稳定整合于靶细胞的基因组、治疗基因表达时间长等优点。慢病毒载体 已成为当前基因治疗中转移载体的研究热点。 本研究通过制备有效的靶向hPIK3cAsbRNA，将其重组、构建至慢病毒载 体，感染Tca8113细胞后检测其对肿瘤细胞的靶向基因沉默效率，探讨其在口腔 鳞癌治疗中的应用前景。 [方法和结果] 第一部分： 靶向hPIl【3CARN舢质粒载体的制备 方法： hpIK3cA—stlI斟A质粒载体的构建和鉴定：选取由上海吉凯基因化学技 术有限公司设计并合成的针对hPI硒cA的siRNA序列(No： DBLv08340)以及通用阴性对照序列，设计合成sh心A01igo，进行 退火最终合成含有干扰序列的带有粘性末端的双链DNA obgo，使用 PAGE凝胶检测双链形成效率；以功口∥渤口J对含lmA聚合酶III u6启动子的载体质粒pGCL—GFP进行双酶切消化，形成不对称的粘 sbRNA 性末端；双链hPI瞄cA oligo表达框架与pGcL—GFP连接；转 化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PcR鉴定与测序。 结果： 针对确定的靶点信息合成的单链shRNA 01igo，退火后形成带粘性末端 的双链DNA ohgo。酶切载体质粒pGCL厂GFP后，质粒由超螺旋状态 转化形成线性化状态，并形成与上述双链sm斟A框架相匹配的粘 性末端。将上述两种双链连接、重组。转化感受态细胞DH50c，于 含有Mgso。和Amp抗性的soB琼脂培养基上培养并筛选出阳性克 隆，对阳性克隆进行PcR鉴定和测序。结果提示：得到完